Урология №4 / 2021
Характеристика патогенного потенциала Escherichia coli, выделенных у пациентов с калькулезным пиелонефритом
ФГБУН «Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза» УрО РАН, Оренбург, Россия
Цель исследования: провести сравнительную фенотипическую и генетическую оценку патогенного потенциала штаммов E. coli, изолированных от пациентов с калькулезным пиелонефритом.
Материалы и методы. Проанализировано 78 штаммов E. coli, выделенных из мочи больных калькулезным пиелонефритом в фазы обострения (n=58) и ремиссии (n=20). Патогены исследовали на наличие генов вирулентности papA, papEF, papGII; afa, bmaE, iutA, fyuA, feoB, kspMTII, usp мультиплексной ПЦР с использованием подобранных праймеров. Фенотипически определяли способность к биопленкообразованию, антилизоцимную, антигемоглобиновую, антицитокиновую, адгезивную и sIgA-протеазную активность E. coli.
Результаты. У штаммов E. coli, выделенной из мочи больных в фазу ремиссии, чаще и с высокими значениями признака регистрировалась способность к образованию биопленок; а у штаммов, изолированных при рецидиве, адгезивная активность, способность к инактивации про- и противовоспалительных цитокинов, антигемоглобиновая активность, а также зарегистрированы гены, кодирующие афимбриальный адгезин (afa), отвечающие за синтез сидерофора аэробактина (iutA), осуществляющие транспорт двухвалентного железа (feoB).
Заключение. Выявленные различия в фено- и генотипическом профилях культур E. coli, изолированных от пациентов с калькулезным пиелонефритом в фазы обострения и ремиссии, позволяют дифференцировать выделенный штамм и прогнозировать течение инфекционно-воспалительного процесса.
Введение. Escherichia coli – общепризнанный возбудитель инфекции мочеполового тракта [1], в частности хронического пиелонефрита [2], наиболее частого (43–100% случаев) осложнения мочекаменной болезни [3].
Комплекс свойств инфекционного агента, обеспечивающий его иммунорезистентность и персистирование в организме хозяина, является составным компонентом патогенного потенциала возбудителя пиелонефрита [4, 5]. Способность эшерихий вызывать инфекционный процесс обусловлена в том числе наличием у них широкого спектра факторов вирулентности, которые детерминируются определенными генами [6, 7].
Цель исследования: провести сравнительную фенотипическую и генетическую оценки патогенного потенциала штаммов E. coli, изолированных от пациентов с калькулезным пиелонефритом.
Материалы и методы. В исследование вошли 78 пациентов, из них 44 (56,4%) женщины в возрасте от 27 до 89 лет (средний возраст – 57 лет). Всем пациентам проведено оперативное лечение по поводу камней почек и верхней трети мочеточников в урологическом отделении Оренбургской областной клинической больницы № 1, от всех пациентов получено информированное согласие. Конкременты из верхней трети мочеточника смещали в лоханку и удаляли методом чрескожной нефролитотрипсии и литоэкстракции. Все операции заканчивались установкой нефростомического дренажа с закрытой системой. При хирургическом вмешательстве отбирали пробы мочи из почечной лоханки для проведения бактериологического исследования. Пробы мочи доставляли в бактериологическую лабораторию в течение 1–2 ч.
Микроорганизмы выделяли в чистой культуре и идентифицировали до вида с использованием биохимических тест-систем «Lachema» («Erba Lachema s.r.o.», ЕС). Все штаммы E. coli были разделены на 2 группы: 1-ю группу составили культуры, выделенные у больных калькулезным пиелонефритом в фазу обострения (n=58); 2-ю – в фазу ремиссии (n=20).
Антилизоцимную и антигемоглобиновую активность микроорганизмов (АЛА и Aнти-HbA) определяли фотометрическим методом [8] способность образовывать биопленки (БО) по методике [9], адгезивную активность – по [10].
Антицитокиновую активность (АЦА) в отношении провоспалительных (IL-6, -8) и противовоспалительных (IL-2, -10, TNF-α) цитокинов определяли по [11], sIgA-протеазную активность – в супернатантах бульонных культур с использованием иммуноферментного анализа [12].
Выделение тотальной ДНК осуществляли из бактериальных суспензий (1,5×108 КОЕ/мл; эквивалентных значению 0,5 стандарта мутности МакФарланда), приготовленных на стерильной воде из суточных агаровых культур E. coli, сорбционным методом с использованием набора реактивов «ДНК-сорб-В» («ИнтерЛабСервис», Россия), согласно рекомендации производителя.
Амплификацию проводили с использованием стандартных наборов на многоканальном амплификаторе «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия) по следующему протоколу: 1 цикл – 94ºC, 5 мин; 30 циклов: 94ºC, 30 с; 55ºC, 30 с; 72ºC, 30 с; последний цикл – 72ºC, 2 мин. Продукты амплификации анализировали путем электрофоретического разделения в горизонтальном 1,7%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, ТАЕ буферной системе с использованием стандартных наборов фирмы «ИнтерЛабСервис».
В качестве маркеров использовали маркер длин ДНК 100+ bp DNA Ladder (ЕвроГен). Положительное заключение о наличии гена делали при обнаружении в дорожке специфической светящейся полосы определенной массы, которую устанавливали по линейке молекулярных масс.
Идентифицировали следующие гены, кодирующие факторы вирулентности микроорганизмов: адгезины (pap – пили, ассоциированные с пиелонефритом: papA, papEF, papGII; afa – афимбриальный фактор адгезии, bmaE – ...
