Иммунологический анализ атеросклеротических бляшек человека в системе культивирования ex vivo

Цель исследования: анализ динамики лимфоцитарного состава атеросклеротических бляшек человека в системе культивирования ex vivo. Материалы и методы. В исследование было включено 15 атеросклеротических бляшек, полученных в результате операций каротидной эндатерэктомии. Бляшки культивировали в виде кольцевидных блоков согласно разработанной ранее методике на коллагеновых губках в культивационной среде подобранного состава в CO2 инкубаторе. В 0-й день, а также в 4-й и 19-й дни культивирования выделяли клетки из эксплантов бляшек и методом мультипараметрической проточной цитометрии анализировали в них содержание B-, Т-лимфоцитов и их субпопуляций, а также CD16+ клеток естественных киллеров (NK). Для этого обрабатывали ткани бляшек созданным ранее ферментативным коктейлем, позволяющим сохранять поверхностные клеточные маркеры, и окрашивали выделенные клетки флуоресцентно-меченными моноклональными антителами к CD45, CD3, CD19, CD4, CD8, CD16. Кроме того, с помощью проточной цитометрии определяли количество интерлейкин-2 (IL-2) и интерферон-гамма (IFN-γ)-продуцирующих Т клеток. Результаты. Через 4 дня культивирования в эксплантах бляшек снижалось общее количество лимфоцитов, однако сохранялись живые лимфоциты (2619.3[1680.4;3478.2] клеток/100мг ткани), в том числе Т-клетки (2123.4[484.9;3181.2] клеток/100 мг ткани), В-клетки (5.6[3.4;27.9] клеток/100 мг ткани) и CD16+ NK-клетки (10.6[1.8;23.7] клеток/100мг ткани). На 4-й день культивирования Т-клетки были представлены CD4+CD8-(797[475.5;1000.7] клеток/100мг ткани, 37.5[32.1;46.3]%) и CD4-CD8+ (686.2[423.6;1158.4] клеток/100мг ткани, 45.6[38.1;47.9]%) субпопуляциями. При этом процент популяции CD4+CD8- Т-клеток снижался относительно 1-го дня культивирования, что коррелировало с приростом содержания CD4-CD8- Т-клеток (p<0.05). Кроме того, через 4 дня культивирования в эксплантах бляшек сохранялись как CD8+(17.5[13.3;19.9]%), так и CD8- (9.9[6.4;14]%) IFN-γ-продуцирующие Т-клетки, однако наблюдалась тенденция к снижению их количества, а также количества IL-2-продуцирующих Т-клеток. Через 19 дней культивирования в эксплантах атеросклеротических бляшек также сохранялись лимфоциты (2830.1[2350.3;5900.2] клеток/100мг ткани), в том числе Т-клетки (2594.5[2035.7;5306.7] клеток/100мг ткани), представленные CD4+CD8- (1016.8[671.2;2201.7] клеток/100мг ткани, 42.3[34.3;47.8]%) и CD4-CD8+ (1534.3[813.8;2207.2] клеток/100мг ткани, 50.8[45.6;56.5]%) субпопуляциями, В клетки (31[18.3;64.4] клеток/100мг ткани) и CD16+ NK клетки 44.9[33.4;138.9] клеток/100 мг ткани. Обсуждение. Разработанная нами ранее ex vivo методика культивирования атеросклеротических бляшек человека позволяет сохранять жизнеспособность различных популяций лимфоцитов в течение 19 дней. Было обнаружено, что в процессе культивирования также сохраняются Т-клетки, способные осуществлять T-хелпер-1-зависимый иммунный ответ, характерный для воспаления в атеросклеротических бляшках. Полученные результаты делают возможным проведение экспериментов по исследованию иммунологических механизмов атерогенеза, а также разработку новых подходов к терапии атеросклероза, направленных на локальное подавление воспаления в бляшке. Выводы. В ex vivo культуре атеросклеротической бляшки человека в течение длительного времени сохраняются CD4+CD8- и CD4-CD8+ Т- и В-лимфоциты, а также CD16+ NK клетки. Более того, при культивировании на 4-й день в ткани также сохраняются IFN-γ+ Т-клетки.

Атеросклеротическое поражение артерий — одна из основных причин смертности в развитых странах. Долгое время в литературе атеросклероз описывался только как следствие нарушенного липидного обмена в ткани. Однако в дальнейшем было обнаружено, что в развитии атеросклероза большую роль играют и другие факторы риска, такие как возраст, артериальная гипертензия, сахарный диабет, курение [1]. Кроме того, многие работы указывают на важную роль воспаления в развитии данной патологии [2]. В ряде иммуногистохимических исследований показано, что в атеросклеротических бляшках (АСБ) содержатся клетки врожденного и адаптивного иммунитета: макрофаги, Т- и В-клетки [3—7]. Участие клеток адаптивного иммунитета в атерогенезе показано на экспериментальных моделях: у мышей без адаптивного иммунитета отмечалось развитие АСБ меньших размеров, чем у мышей дикого типа [8, 9]. Роль адаптивного иммунитета в развитии атеросклероза также подтверждена по косвенным данным. Так, L. Johnasson и соавт. в АСБ человека выявили гладкомышечные клетки, экспрессирующие типичные для антигенпрезентирующих клеток поверхностные молекулы главного комплекса гистосовместимости II (MHC II) [10]. Доказательством участия В-лимфоцитов в атерогенезе послужило обнаружение в АСБ аутологичных антител против окисленных липопротеидов низкой плотности (ЛНП) [11, 12]. Кроме того, экспериментально показана роль костимуляторных молекул Т-лимфоцитов в атерогенезе [13]. В нашей предыдущей работе мы подтвердили участие иммунной системы в атерогенезе, показав, что в АСБ человека Т-лимфоциты находятся в значительно более активированном состоянии, чем в крови тех же пациентов [14]. Возможно, что именно Т-клеткам может принадлежать ведущая роль в активации воспаления при прогрессировании атеросклероза [15].

Таким образом, накоплено значительное количество данных об участии иммунной системы в атерогенезе. Однако большая часть упомянутых экспериментальных исследований проводилась на монослойных культурах клеток, которые не воссоздают микроокружения, типичного для АСБ in vivo [16, 17]. Некоторые исследования проведены также на модельных животных, в частности на мышах, нокаутных по генам аполипопротеинов или рецептора к ЛНП, структура АСБ которых значительно отличается от АСБ человека [18]. В связи с перечисленными недостатками описанных моделей остается открытым вопрос о соответствии полученных на них данных процессам, происходящим в организме человека при атеросклерозе. Необходима разработка более адекватной лабораторной модели, в которой контролируемость внешних параметров сочеталась бы с воспроизведением структуры и микроокружения АСБ, включая разветвленную сеть межклеточных взаимодействий эндотелия и гладкомышечных клеток с клетками иммунной системы. В предыдущей работе на основании методики J.-C. Grivel и L.B. Margolis [19] нами был разработан способ культивирования эксплантов АСБ человека, при котором жизнеспособность и структура ткани сохраняются в течение 20—22 дней [20]. Однако резекция тканей человека является крайне травматичным процессом; более того, при культивировании АСБ помещаются в условия in vitro, что может приводить к изменению фенотипов иммунных клеток в АСБ и их последующей гибели. Таким образом, для изучения роли иммунной системы в атерогенезе в составе АСБ человека необходимо подтверждение жизнеспособности и стабильности фенотипа основных субпопуляций иммунных клеток в тканевой культуре, сохраняющей систему типичных для АСБ межклеточных взаимодействий. В связи с этим целью настоящей работы стало исследование динамики лимфоцитарного состава АСБ в разработанной нами ранее системе ex vivo.

Материал и методы

Пациенты. Мы проанализировали 15 АСБ человека, полученных в результате операции каротидной эндатерэктомии в Институте хирургии им. А.В. Вишневского. Среди пациентов было 66,7% мужчин и 33,3% женщин, средний возраст пациентов составил 66,6±8,1 года. Все пациенты подписали информированное согласие для использования операционного материала в данном исследовании.

Культура ткани. АСБ были доставлены в лабораторию в стерильной среде RPMI 1640 Advanced с добавлением раствора антибиотика/антимикотика (в итоговой концентрации 100 ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина, 0,25 мг/мл амфотерицина B). Подготовку материала осуществляли не позже чем через 2 ч после операции. Культивирование АСБ проводили по разработанной ранее методике [20]. В стерильных условиях пригодные для культивирования участки АСБ (без ярко выраженной кальцификации или атероматоза) были разрезаны перпендикулярно длине сосуда на кольцевидные блоки толщиной 2 мм.

Ткань культивировали на коллагеновых губках в 35-миллиметровых чашках Петри с 3 мл культивационной среды RPMI 1640 Advanced с добавлением 100 мк...

Воробьева Д.А., Лебедева А.М., Вагида М.С., Иванова О.И., Фелькер Е.И., В.Н. Гонтаренко, Шпектор А.В., Марголис Л.Б., Е.Ю. Васильева Е.Ю.