Исследование циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников у больных с хронической сердечной недостаточностью

Обследован 41 больной ишемической болезнью сердца (n=26) и дилатационной кардиомиопатией — ДКМП (n=15). Контрольную группу составили 15 практически здоровых лиц. Не выявлено существенных различий по представительству клеток CD34+CD133+ и CD34+CD133+VEGFR-2+ в периферической крови у больных с хронической сердечной недостаточностью (ХСН), но отмечено снижение уровня клеток CD34–CD133+VEGFR-2+, преимущественно в группе ДКМП. Наиболее значимыми факторами, определяющими снижение числа циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников (ЭКП), были возраст обследованных, уровень холестерина липопротеидов низкой плотности и толщина комплекса интима—медиа общих сонных артерий. Констатировано снижение колониеобразующей способности ЭКП у больных с ХСН, прежде всего в группе больных с ДКМП. Нарушение качественного и количественного состава ЭКП может рассматриваться в качестве одного из факторов риска развития дисфункции эндотелия, патологического ремоделирования сердечно-сосудистой системы и прогрессирования ХСН.

Несмотря на успехи, достигнутые в лечении боль­ных с хронической сердечной недостаточностью (ХСН), смертность при данной патологии в 6—7 раз превышает среднепопуляционную [1, 2]. Еще более пессимистичны­ми выглядят результаты клинико-эпидемиологического исследования, проведенного в Нижегородской области. Выживаемость больных с ХСН I—IV функционально­го класса (ФК) в Российской Федерации по данным за 2000—2002 гг. соответствует показателям 1988—1993 гг. в международных клинических исследованиях [3]. Столь неутешительные результаты заставляют клиницистов искать новые подходы к профилактике и лечению ХСН.

В конце 90-х годов XX века появились первые клини­ко-морфологические и экспериментальные подтверж­дения участия циркулирующих стволовых и частично дифференцированных клеток-предшественников в вос­становлении поврежденного миокарда [4, 5]. Однако наибольшее развитие получили работы, посвященные изучению роли циркулирующих эндотелиальных клеток-предшественников (ЭКП) в регенерации эндотелия и образовании новых сосудов [6, 7]. В настоящее время при проведении клинических исследований для иденти­фикации ЭКП предложено более 20 иммунофенотипических маркеров, что затрудняет интерпретацию данных, получаемых в различных исследовательских центрах [8]. Однако не только методическими особенностями можно объяснить многообразие имеющихся в литературе сведе­ний о количестве и свойствах циркулирующих ЭКП при сердечно-сосудистых заболеваниях (ССЗ). Популяция ЭКП гетерогенна, и к ней традиционно относят частич­но дифференцированные стволовые клетки различно­го происхождения: гемопоэтические, мезенхимальные и резидентные клетки сосудистой стенки [9]. Поэтому индивидуальный подход к оценке репарационного потен­циала у больных с ХСН и к решению вопросов клеточной трансплантологии, связанных с выбором оптимального клеточного трансплантата, объемом и характером сопро­водительной терапии, а также с кратностью и методом введения стволовых клеток, невозможен без детально­го изучения количественного и качественного состава субпопуляций циркулирующих стволовых клеток и их пролиферативной активности. Поэтому цель настоящего исследования — охарактеризовать профиль и функцио­нальные свойства циркулирующих ЭКП у больных с сис­толической дисфункцией левого желудочка различной природы.

Материал и методы

Обследованы 26 больных с документированной ишеми­ческой болезнью сердца (ИБС) и систолической дисфун­кцией левого желудочка (ЛЖ) (фракция выброса — ФВ по Симпсону <40%). Диагноз ИБС подтвержден на осно­вании перенесенного инфаркта миокарда с патологичес­ким зубцом Q или зафиксированного повышения уровня маркеров повреждения миокарда, а также по данным коронарографии. У 15 пациентов после исключения ИБС и активного миокардита диагностирована дилатационная кардиомиопатия (ДКМП). У всех пациентов с ХСН име­лись синусовый ритм, стабильное клиническое состояние, они получали неизменную терапию в течение не менее 4 нед до включения в исследование. Контрольную груп­пу составили 15 практически здоровых лиц (12 мужчин и 3 женщины, средний возраст 41, 1±2,1 года, индекс массы тела 25,3±0,7 кг/м²). Клинико-демографическая характеристика групп представлена в табл. 1.

Таблица 1. Клиническая характеристика больных с ХСН.

Примечание. ^#— данные представлены в виде абсолютного числа больных (%); * — p<0,05; ** — p<0,01. ХСН — хроническая сердечная недостаточность; ИБС — ишемическая болезнь сердца; ДКМП — дилатационная кардиомиопатия; ФК — функциональный класс; ТШХ — тест с 6-минутной ходьбой; АПФ — ангиотензинпревращающий фермент; БРА—блокаторы рецепторов ангиотензина II; ЛЖ — левый желудочек; КДР — конечный диастолический размер; КСР — конечный систолический размер; МЖПд — толщина межжелудочковой перегородки в диастолу; ЗСд — толщина задней стенки в диастолу; ФВ — фракция выброса; ЭЗВД — эндотелийзависимая вазодилатация в пробе с реактивной гиперемией; ТИМ — толщина комплекса интима—медиа.

У всех больных с ХСН выполняли стандартную эхокардиографию на аппарате Philips iE33 (США). Ультразвуковое исследование плечевой артерии (ПА) и дуплексное сканирование общих сонных артерий про­водили на ультразвуковом аппарате Vivid 7 Pro (GE, США). Эндотелийзависимую вазодилатацию (ЭЗВД) ПА оценивали в ходе пробы с реактивной гиперемией по методу, предложенному D. Celermajer в модификации Y. Hirooka [10, 11]. Для оценки изменения диаметра ПА использовали линейный датчик 10 МГц. ПА лоцировали в продольном сечении на 2—5 см выше локтевого сгиба. Полученное изображение синхронизировали с зубцом R на электрокардиограмме. Исследование проводили в дуплексном режиме (В-режим, цветовое допплеровское картирование потока). Диаметр ПА измеряли в состоя­нии покоя после 10-минутного отдыха и повторно после 5-минутной ишемии конечности, вызванной пережатием ПА с помощью манжеты сфигмоманометра, которую накладывали выше места визуализации ПА и накачивали до уровня давления, превышающего на 50 мм рт.ст. сис­толическое артериальное давление пациента. Реакцию ПА на пробу с реактивной гиперемией определяли на 60-й секунде после декомпрессии. Изменения диамет­ра ПА оценивали в процентном отношении от исходного (до пробы). Признаком дисфункции эндотелия считали расширение ПА менее 10% [12].

Для оценки физической работоспособности больных с ХСН и объективизации их функционального стату­са использовали тест с 6-минутной ходьбой (ТШХ). Липидный состав крови определяли ферментатив­ным методом на биохимическом анализаторе Hitachi 902 с помощью реактивов фирмы Roche. Уровень С-реактивного белка (СРБ) определяли ультрачувствительным латексным методом (TINA-QUANT, Roche).

Количество клеток CD34+, CD133+, VEGFR-2+ в пери­ферической крови оценивали методом проточной цито­метрии (FACSCalibur, Becton Dikinson, США) с использо­ванием моноклональных антител к CD34, меченных флюоресцеинизотиоциантом (FITC, Immunotech™), CD133, меченных фикоэритрином (PE, Macs™), и VEGFR-2, меченных аллофикоцианином (APC, R&D™).

Для оценки пролиферативной активности циркулиру­ющих ЭКП по методу J.M. Hill мононуклеарные лейко­циты получали путем дифференциального центрифуги­рования в градиенте плотности 1,077 (Histopaque, Sigma, США) из венозной крови, стабилизированной гепари­ном (10 ед./мл) [13]. Фракцию мононуклеарных клеток для дальнейших исследований трижды отмывали центри­фугированием при 1000 об/мин по 10 мин в 10-кратном объеме 0,1 М фосфатного буфера. Полученные клетки в количестве 107 на лунку культивировали в 6-луночном планшете, покрытом желатином, в среде ДМЕМ (knockout™ D-MEM, Invitrogen) с добавлением глю­тамина, 2% фетальной бычьей сыворотки (Invitrogen), 40 мкг/мл гентамицина и факторов роста (VEGF, b-FGF, EGF, Sigma, США) из расчета 10 нг/мл. Неприкрепившиеся клетки через 48 ч пересаживали в 35-миллиметровые покрытые желатином чашки с плот­ностью 5-10⁶ клеток в 2 мл среды. Пролиферативную активность ЭКП оценивали через 7 дней путем подсчета колониеобразующих единиц в 10 полях зрения в 3 парал­лельных пробах. Результат представлен в виде среднего количества колоний на 1 мм². Принадлежность культиви­руемых клеток к ЭКП подтверждали методами проточной цитометрии с использованием моноклональных анти­тел CD34-FITC, VEGFR-2-APC, CD117-PE, CD105-PE, CD90-FITC, CD45-FITC...

0,05;>

40%).>

Моисеева О.М., Карелкина Е.В., Морошкин В.С., Селютин А.В., Шляхто Е.В.