Исследование действия антимикотических препаратов на биопленки, сформированные грибами рода Candida

Цель работы. Оценить антибиопленочный и антикандидозный эффект некоторых актуальных антимикотических препаратов (композиция «кетоконазол-полиэтиленоксиды», нистатина, флуконазола) в отношении биопленочных клеток грибов рода Candida.
Материал и методы. В работе использовались следующие методы: 1) моделирование биопленок грибов рода Candida в условиях in vitro; 2) исследование биопленочной антибиотикорезистентности грибов рода Candida на основе оценки их жизнеспособности методом колониеобразующих единиц; 3) оценка патогенности кандид на основе исследования гифообразования методом дифференциально-интерференционного контраста; 4) сканирующая электронная микроскопия; 5) лазерная сканирующая конфокальная микроскопия. Биопленки были сформированы на основе штаммов C. albicans, C. glabrata и C. parapsilosis.
Результаты. Из исследованных антимикотических (антикандидозных) препаратов самый сильный антибиопленочный эффект проявляла композиция «кетоконазол-ПЭО», которая при 48-часовой экспозиции с кандидозными биопленками вызывала гибель 100% клеток у всех изученных штаммов. Композиция «кетоконазол-ПЭО» демонстрировала антивирулентные свойства – подавляла гифообразование в ранних (24 часа) биопленках.
Заключение. Композиция «кетоконазол-ПЭО» может эффективно использоваться для борьбы с кандидозными биопленками.

Грибы рода Candida являются актуальными возбудителями инфекционной патологии человека [1]. Наиболее распространенной формой кандидоза является вульвовагинальный кандидоз: 75% женщин не менее 1 раза в жизни проходят курс лечения от этой патологии, у 5–8% из этих женщин кандидоз приобретает рецидивирующее течение [2]. Патогенез вульвовагинального кандидоза связан с образованием биопленок [3]. Биопленка – система, состоящая из микробных клеток, ассоциированных с внеклеточным матриксом и расположенная на какой-либо поверхности [4]. Внутри биопленок микроорганизмы (бактерии либо микроскопические грибы) при- обретают качественно новые свойства по сравнению с микробами, находящимися в планктонной (небиопленочной) форме. В составе биопленок микробы могут приобретать повышенную устойчивость к эффекторным воздействиям иммунной системы, действию антибиотиков и дезинфектантов [5, 6]. Например, у С. albicans, находящихся в составе биопленок, в 10–32 раза повышается устойчивость к амфотерицину B [7] и в 2–4 раза к флуконазолу [8]. В клинических условиях такая высокая выживаемость биопленочных микробов ведет к рецидивированию и хронизации инфекционного процесса. Конечно, чувствительность биопленок к антибиотикам зависит от многих параметров, к числу которых относятся видовые и штаммовые свойства формирующих биопленку микробов, локализация биопленки и даже особенности местной реакции организма на биопленку [9, 10]. Рутинные методы определения чувствительности к антибиотикам, которые проводятся на небиопленочных микробах, не могут дать адекватную оценку антибиотикорезистентности микробов, находящихся в глубоких слоях биопленок. В связи с вышеизложенным современная медицинская наука настаивает на проведении особого тестирования антимикробных препаратов, которое должно быть направлено на определение их эффективности в отношении биопленочных микробов [11–13].

Цель настоящей работы – оценить антибиоп- леночный и антикандидозный эффект некоторых актуальных антимикотических препаратов (АМП) (композиции «кетоконазол-полиэтиленоксиды», нистатина, флуконазола) в отношении биопленочных клеток грибов рода Candida.

Материал и методы исследования

Для получения биопленок использовали четыре штамма грибов рода Candida, выделенные из клинических источников: C. albicans (штамм 201 и штамм 186), C. glabrata (штамм 302), C. parapsilosis (штамм 187).

Клетки кандид культивировались в 0,5% пептоне (Becton, Dickinson and Company), содержащем 2% глюкозы (рН 7,0). Через 24 ч инкубации (37oC) взвесь клеток разводили тем же бульоном до показателя мутности 0,5 на приборе DensiLaMeter II (ERBA Lachema); 1 мл содержал примерно 108 колониеобразующих единиц (КОЕ) кандид. По 0,35 мл полученной взвеси вносили в лунки 96-луночного планшета (Cellstar, Greiner Bio-one), инкубировали как стационарную культуру в течение 48 ч при 37оС. Факт образования биопленок контролировали, используя лазерную сканирующую конфокальную микроскопию (ЛСК-микроскопию). Через 48 ч инкубации надосадочная жидкость была удалена, на биопленки наслаивали по 0,35 мл 0,5% пептона с 2% глюкозы, содержащего АМП. В качестве АМП использовали: композиция «кетоконазол-полиэтиленоксиды (далее – «кетоконазол-ПЭО»)» (кетоконазол – 6 мкг/мл, ПЭО 1500 – 33 мкг/мл, ПЭО 400 – 3,8 мкг/мл), нистатин (14 ЕД/мл), флуконазол (8 мкг/мл). Дозировки препаратов были выбра- ны исходя из их рекомендуемой терапевтической концентрации в тканях; согласно рекомендациям Национального Комитета Клинических Лабораторных Стандартов (США) потеря жизнеспособности при обработке подобными концентрациями считается критерием «чувствительности» биопленочных кандид к АМП. Тон...

Чеботарь И.В., Паршиков В.В.