Акушерство и Гинекология №2 / 2018
Исследование уровня мРНК генов в ткани эндометрия у женщин репродуктивного возраста с внутриматочными синехиями
ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, Москва
Цель исследования. Выявление молекулярно-генетических маркеров формирования внутриматочных синехий для усовершенствования тактики ведения женщин репродуктивного возраста.
Материал и методы. В ходе проспективного исследования обследованы 20 пациенток, проходивших оперативное лечение в гинекологическом отделении ФГБУ НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова. Пациентки были разделены на 2 группы: 1-я группа – пациентки с внутриматочными синехиями (основная группа), 2-я группа – условно здоровые женщины (группа сравнения). Образцы тканей эндометрия были взяты в предоперационном периоде при помощи пайпель-биопсии с последующим получением профиля экспрессии с помощью гибридизации на микрочипах GeneChip Human Exon 1.0 ST Arrays (Affymetrix, США) согласно протоколу производителя. Биоинформатический анализ данных, полученных с помощью микроматричного анализа, проведен с помощью сервиса Gene Ontology.
Результаты. В эндометрии женщин с внутриматочными синехиями выявлено повышение уровня мРНК 9 генов и понижение уровня мРНК 2 генов по сравнению с эндометрием женщин группы сравнения. По данным биоинформатического анализа выявлено, что 6 из 9 генов задействованы в процессах иммунного ответа, в том числе активации нейтрофилов, 4 из 9 генов задействованы в экзоцитозе.
Заключение. Вовлеченность большинства обнаруженных генов в процессы иммунного ответа, воспаления, апоптоза и экзоцитоза позволяют предположить наличие отклонений в протекании межклеточного взаимодействия у пациенток с внутриматочными синехиями. Изменение уровня мРНК генов S100A8, HBB, VNN2, RGS2, ERAP2, AQP9, MNDA, TUBA3E, FSGR3B в эндометрии у женщин с внутриматочными синехиями может служить основой для создания тест-систем, предназначенных для детекции уровня мРНК методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в качестве малоинвазивного теста для оптимизации тактики ведения женщин репродуктивного возраста с внутриматочными синехиями.
Внутриматочные синехии представляют собой состояние, характеризующееся нарушением анатомической целостности полости матки за счет образования спаек разной степени выраженности. В последние десятилетия в связи со значительным повышением частоты внутриматочных вмешательств, распространенность внутриматочных синехий увеличилась, составляя, по данным разных авторов от 0,3 до 21,5% [1–5]. Несмотря на множество предложенных вариантов лечения и профилактики, высока вероятность рецидива данного состояния, в особенности при тяжелой степени, характеризующейся значительной облитерацией полости матки. Процессы фиброза эндометрия, происходящие при внутриматочных синехиях, характеризуются избыточным осаждением и реорганизацией внеклеточного матрикса (ВКМ), который «замещает» здоровый эндометрий [3]. Результаты биопсии эндометрия при внутриматочных синехиях подтвердили наличие 50–80% фиброзной ткани, когда как содержание фиброзной ткани в эндометрии здоровых женщин составляло 13–20% [6]. Публикации последних лет немаловажную роль в формировании фиброзной ткани отводят процессам гипоксии, пониженной неоваскуляризации, аномальной экспрессии цитокинов, нарушению взаимодействия в сигнальных путях [2, 7, 8]. Однако, несмотря на наличие большого количества проведенных исследований, механизм формирования внутриматочных синехий, необходимый для создания новых методов таргетной терапии и профилактики, недостаточно изучен.
Современные технологии – микроматричный анализ и высокопроизводительное секвенирование – позволяют оценить транскрипционную активность широкого спектра генов. Предложенные технологии стали основой нескольких десятков публикаций в литературе, основанных на различии транскрипционных профилей генов при том или ином заболевании. Так, обнаружены гены-кандидаты патофизиологических изменений, происходящих в эндометрии пациенток при эндометриозе, преэклампсии, раке яичников [9–11]. Принимая во внимание результаты этих публикаций, целью нашего исследования стало выявление генов, экспрессия которых отличается у пациенток с внутриматочными синехиями, по сравнению с эндометрием условно здоровых женщин.
Материал и методы исследования
На базе отделения оперативной гинекологии и лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России проведено проспективное исследование 20 пациенток репродуктивного возраста, которые прошли полное клинико-лабораторное обследование и лечение в 2015–2016 гг. Все пациентки перед включением в исследование подписали добровольное информированное согласие. Исследование было одобрено комитетом по этике ФГБУ НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова Минздрава России. Пациентки были разделены на 2 группы: 1-я группа – женщины с внутриматочными синехиями; 2-я группа – условно здоровые женщины. Критериями включения в исследование были: возраст пациенток от 18 до 45 лет, наличие внутриматочных синехий, выявленных с использованием инструментальных методов обследования и подтвержденных гистологическим исследованием, пролиферативная фаза менструального цикла; отсутствие патологических изменений в эндометрии по результатам гистологического исследования. Критериями исключения из исследования были: возраст пациенток менее 18 и больше 45 лет, прием гормональных препаратов на момент обращения, тяжелая сопутствующая соматическая патология, злокачественные новообразования, острые воспалительные заболевания органов малого таза. Гистероскопический этап выполняли по стандартной методике в отделении оперативной гинекологии в условиях соответствующего анестезиологического обеспечения.
В качестве материала для исследования были использованы образцы пролиферативного эндометрия, взятые в предоперационном периоде при помощи пайпель-биопсии в контейнеры с транспортной средой «Стор-экс» («ДНК-технология», Россия) до гистероскопии с последующим диагностическим выскабливанием эндометрия и гистологическим исследованием. Хранение образцов эндометрия производилось в биобанке ФГБУ НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова Минздрава России при температуре -70°C.
Процедура выделения 500 нг РНК каждого образца с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, США) проводилась по стандартной методике с предварительным синтезированием целевой кДНК с помощью транскрипции с последующей фрагментацией образцов согласно протоколу производителя (Affymetrix, США). Для гибридизации образцов использовались микрочипы GeneChip Human Exon 1.0 ST Arrays (Affymetrix, США) с экспозицией 60 об./мин в течение 17 часов при 45°C. Промывка и окрашивание микрочипов осуществлялись на Fluidic Station 450 (Affymetrix, США), сканирование – на сканере Affymetrix GeneChip 3000 7G (Affymetrix, США). Для получения файлов-изображений DAT микромассивов использовался пакет программ Affymetrix GeneChip Command Console (version 0.0.0.676, Affymetrix). Полученные данные были проанализированы с использованием программ Expression Console и TAC (Transcriptone Ana...
