Исследование уровня мРНК генов в ткани эндометрия у женщин репродуктивного возраста с внутриматочными синехиями

DOI: https://dx.doi.org/10.18565/aig.2018.2.56-64

28.02.2018
239

ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, Москва

Цель исследования. Выявление молекулярно-генетических маркеров формирования внутриматочных синехий для усовершенствования тактики ведения женщин репродуктивного возраста.
Материал и методы. В ходе проспективного исследования обследованы 20 пациенток, проходивших оперативное лечение в гинекологическом отделении ФГБУ НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова. Пациентки были разделены на 2 группы: 1-я группа – пациентки с внутриматочными синехиями (основная группа), 2-я группа – условно здоровые женщины (группа сравнения). Образцы тканей эндометрия были взяты в предоперационном периоде при помощи пайпель-биопсии с последующим получением профиля экспрессии с помощью гибридизации на микрочипах GeneChip Human Exon 1.0 ST Arrays (Affymetrix, США) согласно протоколу производителя. Биоинформатический анализ данных, полученных с помощью микроматричного анализа, проведен с помощью сервиса Gene Ontology.
Результаты. В эндометрии женщин с внутриматочными синехиями выявлено повышение уровня мРНК 9 генов и понижение уровня мРНК 2 генов по сравнению с эндометрием женщин группы сравнения. По данным биоинформатического анализа выявлено, что 6 из 9 генов задействованы в процессах иммунного ответа, в том числе активации нейтрофилов, 4 из 9 генов задействованы в экзоцитозе.
Заключение. Вовлеченность большинства обнаруженных генов в процессы иммунного ответа, воспаления, апоптоза и экзоцитоза позволяют предположить наличие отклонений в протекании межклеточного взаимодействия у пациенток с внутриматочными синехиями. Изменение уровня мРНК генов S100A8, HBB, VNN2, RGS2, ERAP2, AQP9, MNDA, TUBA3E, FSGR3B в эндометрии у женщин с внутриматочными синехиями может служить основой для создания тест-систем, предназначенных для детекции уровня мРНК методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в качестве малоинвазивного теста для оптимизации тактики ведения женщин репродуктивного возраста с внутриматочными синехиями.

Внутриматочные синехии представляют собой состояние, характеризующееся нарушением анатомической целостности полости матки за счет образования спаек разной степени выраженности. В последние десятилетия в связи со значительным повышением частоты внутриматочных вмешательств, распространенность внутриматочных синехий увеличилась, составляя, по данным разных авторов от 0,3 до 21,5% [1–5]. Несмотря на множество предложенных вариантов лечения и профилактики, высока вероятность рецидива данного состояния, в особенности при тяжелой степени, характеризующейся значительной облитерацией полости матки. Процессы фиброза эндометрия, происходящие при внутриматочных синехиях, характеризуются избыточным осаждением и реорганизацией внеклеточного матрикса (ВКМ), который «замещает» здоровый эндометрий [3]. Результаты биопсии эндометрия при внутриматочных синехиях подтвердили наличие 50–80% фиброзной ткани, когда как содержание фиброзной ткани в эндометрии здоровых женщин составляло 13–20% [6]. Публикации последних лет немаловажную роль в формировании фиброзной ткани отводят процессам гипоксии, пониженной неоваскуляризации, аномальной экспрессии цитокинов, нарушению взаимодействия в сигнальных путях [2, 7, 8]. Однако, несмотря на наличие большого количества проведенных исследований, механизм формирования внутриматочных синехий, необходимый для создания новых методов таргетной терапии и профилактики, недостаточно изучен.

Современные технологии – микроматричный анализ и высокопроизводительное секвенирование – позволяют оценить транскрипционную активность широкого спектра генов. Предложенные технологии стали основой нескольких десятков публикаций в литературе, основанных на различии транскрипционных профилей генов при том или ином заболевании. Так, обнаружены гены-кандидаты патофизиологических изменений, происходящих в эндометрии пациенток при эндометриозе, преэклампсии, раке яичников [9–11]. Принимая во внимание результаты этих публикаций, целью нашего исследования стало выявление генов, экспрессия которых отличается у пациенток с внутриматочными синехиями, по сравнению с эндометрием условно здоровых женщин.

Материал и методы исследования

На базе отделения оперативной гинекологии и лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России проведено проспективное исследование 20 пациенток репродуктивного возраста, которые прошли полное клинико-лабораторное обследование и лечение в 2015–2016 гг. Все пациентки перед включением в исследование подписали добровольное информированное согласие. Исследование было одобрено комитетом по этике ФГБУ НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова Минздрава России. Пациентки были разделены на 2 группы: 1-я группа – женщины с внутриматочными синехиями; 2-я группа – условно здоровые женщины. Критериями включения в исследование были: возраст пациенток от 18 до 45 лет, наличие внутриматочных синехий, выявленных с использованием инструментальных методов обследования и подтвержденных гистологическим исследованием, пролиферативная фаза менструального цикла; отсутствие патологических изменений в эндометрии по результатам гистологического исследования. Критериями исключения из исследования были: возраст пациенток менее 18 и больше 45 лет, прием гормональных препаратов на момент обращения, тяжелая сопутствующая соматическая патология, злокачественные новообразования, острые воспалительные заболевания органов малого таза. Гистероскопический этап выполняли по стандартной методике в отделении оперативной гинекологии в условиях соответствующего анестезиологического обеспечения.

В качестве материала для исследования были использованы образцы пролиферативного эндометрия, взятые в предоперационном периоде при помощи пайпель-биопсии в контейнеры с транспортной средой «Стор-экс» («ДНК-технология», Россия) до гистероскопии с последующим диагностическим выскабливанием эндометрия и гистологическим исследованием. Хранение образцов эндометрия производилось в биобанке ФГБУ НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова Минздрава России при температуре -70°C.

Процедура выделения 500 нг РНК каждого образца с использованием набора RNeasy Mini Kit (Qiagen, США) проводилась по стандартной методике с предварительным синтезированием целевой кДНК с помощью транскрипции с последующей фрагментацией образцов согласно протоколу производителя (Affymetrix, США). Для гибридизации образцов использовались микрочипы GeneChip Human Exon 1.0 ST Arrays (Affymetrix, США) с экспозицией 60 об./мин в течение 17 часов при 45°C. Промывка и окрашивание микрочипов осуществлялись на Fluidic Station 450 (Affymetrix, США), сканирование – на сканере Affymetrix GeneChip 3000 7G (Affymetrix, США). Для получения файлов-изображений DAT микромассивов использовался пакет программ Affymetrix GeneChip Command Console (version 0.0.0.676, Affymetrix). Полученные данные были проанализированы с использованием программ Expression Console и TAC (Transcriptone Ana...

Список литературы

1. Хириева П.М., Адамян Л.В., Мартынов С.А. Современные методы профилактики и лечения внутриматочных синехий (обзор литературы). Гинекология. 2016; 18(5): 32-6.

2. Xue X., Chen Q., Zhao G., Zhao J.Y., Duan Z., Zheng P.S. The overexpression of TGF-β and CCN2 in intrauterine adhesions involves the NF-κB signaling pathway. PLoS One. 2015; 10(12): e0146159. doi: 10.1371/ journal.pone.0146159.

3. March C.M. Asherman's syndrome. Semin. Reprod. Med. 2011; 29(2): 83-94.

4. Аракелян А.С., Мартынов С.А., Хорошун Н.Д., Хириева П.М., Степанян А.А., Данилов А.Ю., Козаченко А.В., Адамян Л.В. Диагностика и хирургическая коррекция несостоятельности рубца на матке после кесарева сечения с использованием лапароскопии и гистероскопии. В кн.: Сухих Г.Т., Адамян Л.В., ред. Материалы XXIX конгресса «Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний» Москва, 7-10 июня 2016 г. М.; 2016: 179-80.

5. Arakelyan A.S., Adamyan L.V., Danilov A.Y., Kozachenko A.V., Stepanian A.A. Role of laparoscopy and hysteroscopy in the evaluation of uterine scar after cesarean section and its surgical correction. J. Minim. Invasive Gynecol. 2015; 22(6, Suppl.): S211. doi: 10.1016/j.jmig.2015.08.753.

6. Deans R., Abbott J. Review of intrauterine adhesions. J. Minim. Invasive Gynecol. 2010; 17(5): 555-69.

7. Хириева П.М., Мартынов С.А., Быстрицкий А.А., Адамян Л.В. Генетические факторы риска формирования внутриматочных синехий. Проблемы репродукции. 2017; 23(1): 43-7.

8. Tao Z., Duan H. Expression of adhesion-related cytokines in the uterine fluid after transcervical resection of adhesion. Zhonghua Fu Chan Ke Za Zhi. 2012; 47(10): 734-7.

9. Ashburner M., Ball C.A., Blake J.A., Botstein D., Butler H., Cherry J.M. et al. Gene ontology: tool for the unification of biology. Nat. Genet. 2000; 25(1): 25-9.

10. The Gene Ontology Consortium. Expansion of the Gene Ontology knowledgebase and resources. Nucleic Acids Res. 2017; 45(D1): D331-8.

11. Кузнецова М.В., Пшеничнюк Е.Ю., Бурменская О.В., Асатурова А.В., Трофимов Д.Ю., Адамян Л.В. Исследование экспрессии генов в эутопическом эндометрии женщин с эндометриоидными кистами яичников. Акушерство и гинекология. 2017; 8: 93-102. http://dx.doi.org/10.18565/aig.2017.8.93-102

12. Schiopu A., Cotoi O.S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013; 2013: 828354. doi: 10. 1155/2013/828354 PMID: 24453429.

13. Shah R.D., Xue C., Zhang H., Tuteja S., Li M., Reilly M.P. et al. Expression of calgranulin genes S100A8, S100A9 and S100A12 is modulated by n-3 PUFA during inflammation in adipose tissue and mononuclear cells. PLoS One. 2017; 12(1): e0169614. doi: 10.1371/journal. pone.0169614.

14. Trostrup H., Lerche C., Christophersen L., Thomsen K., Jensen P., Hougen H. et al. Chronic Pseudomonas aeruginosa biofilm infection impairs murine S100A8/A9 and neutrophil effector cytokines- implications for delayed wound closure? Pathog. Dis. 2017; 75(7). doi: 10.1093/femspd/ftx068.

15. Sayasith K., Sirois J., Lussier G. Expression, regulation, and promoter activation of vanin-2 (VNN2) in bovine follicles prior to ovulation. Biol. Reprod. 2013; 89(4): 98.

16. Pouyet L., Roisin-Bouffay C., Clґement A., Millet V., Garcia S., Chasson L. et al. Epithelial vanin-1controls inflammation-driven carcinogenesis in the colitis-associated colon cancer model. Inflamm. Bowel Dis. 2010; 16: 96-104.

17. Wilson M.J., Jeyauriaa P., Parker K.L., Koopman P. The transcription factors steroidogenic factor-1 and SOX9 regulate expression of Vanin-1 during mouse testis development. J. Biol. Chem. 2005; 280(7): 5917-23.

18. Kaur K., Kehrl J.M., Charbeneau R.A., Neubig R.R. RGS-insensitive G alpha subunits: probes of G alpha subtype-selective signaling and physiological functions of RGS proteins. Methods Mol. Biol. 2011; 756: 75-98.

19. Hamel M., Dufort I., Robert C., Leveille M.C., Leader A., Sirard M.A. Genomic assessment of follicular marker genes as pregnancy predictors for human IVF. Mol. Hum. Reprod. 2010; 16: 87-96. doi: 10.1093/molehr/gap079.

20. Feuerstein P., Puard V., Chevalier C., Teusan R., Cadoret V., Guerif F. et al. Genomic assessment of human cumulus cell marker genes as predictors of oocyte developmental competence: impact of various experimental factors. PLoS One. 2012; 7: e40449. doi: 10.1371/journal.pone.0040449.

21. Karppanen T., Kaartokallio T., Klemetti M., Heinonen S., Kajantie E., Kere J. et al. An RGS2 3′UTR polymorphism is associated with preeclampsia in overweight women. BMC Genetics. 2016; 17: 121. doi: 10.1186/s12863-016-0428-8.

22. Andreґs A.M., Dennis M.Y., Kretzschmar W.W., Cannons J.L., Lee-Lin S.Q. et al. Balancing selection maintains a form of ERAP2 that undergoes. Nonsense-mediated decay and affects antigen presentation. PLoS Genet. 2010; 6(10): e1001157. doi: 10.1371/journal.pgen.1001157.

23. Johnson M.P., Roten L.T., Dyer T.D., East C.E., Forsmo S., Blangero J. et al. The ERAP2 gene is associated with preeclampsia in Australian and Norwegian populations. Hum. Genet. 2009; 126(5): 655-66.

24. Founds S.A., Conley Y.P., Lyons-Weiler J.F., Jeyabalan A., Hogge W.A., Conrad K.P. Altered global gene expression in first trimester placentas of women destined to develop preeclampsia. Placenta. 2009; 30(1): 15-24.

25. Fruci D., Giacomini P., Nicotra M.R., Forloni M., Fraioli R., Saveanu L. et al. Altered expression of endoplasmic reticulum aminopeptidases ERAP1 and ERAP2 in transformed non-lymphoid human tissues. J. Cell. Physiol. 2008; 216(3): 742-9.

26. Skowronski M.T. Distribution and quantitative changes in amounts of aquaporin 1, 5 and 9 in the pig uterus during the estrous cycle and early pregnancy. Reprod. Biol. Endocrinol. 2010; 8: 109.

27. Marino G., Castro-Parodi M., Dietrich V., Damiano A. High levels of human chorionic gonadotropin (hCG) correlate with increased aquaporin-9 (AQP9) expression in explants from human preeclamptic placenta. Reprod. Sci. 2010; 17(5): 444-53. doi: 10.1177/1933719110361385.

28. Milot E., Fotouhi-Ardakani N., Filep J.G. Myeloid nuclear differentiation antigen, neutrophil apoptosis and sepsis. Front. Immun. 2012; 3: 397. doi: 10.3389/fimmu.2012.00397.

29. Blum K.S., Tong Y., Siebert R., Marget M., Humpe A., Neppert J., Flesch B.K. Evidence for gene recombination in FCGR3 gene variants. Vox Sang. 2009; 97(1): 69-76.

30. McKinney C., Broen J.C.A., Vonk M.C., Beretta L., Hesselstrand R., Hunzelmann N. et al. Evidence that deletion at FCGR3B is a risk factor for systemic sclerosis. Genes Immun. 2012;13(6): 458-60.

31. Wride M.A., Mansergh F.C., Adams S., Everitt R., Minnema S.E., Rancourt D.E., Evans M.J. Expression profiling and gene discovery in the mouse lens. Mol. Vis. 2003; 9: 360-96.

32. Newton D.A., Rao K.M., Dluhy R.A., Baatz J.E. Hemoglobin is expressed by alveolar epithelial cells. J. Biol. Chem. 2006; 281(9): 5668-76.

33. Crawford M.J., Goldberg D.E. Regulation of the Salmonella typhimurium flavo hemoglobin gene. A new pathway for bacterial gene expression in response to nitric oxide. J. Biol. Chem. 1998; 273(51): 34028-32.

34. Gross S.S., Lane P. Physiological reactions of nitric oxide and hemoglobin: a radical rethink. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96(18): 9967-9.

35. Dassen H., Punyadeera C., Kamps R., Klomp J., Dunselman G., Dijcks F. et al. Progesterone regulation of implantation-related genes: new insights into the role of oestrogen. Cell. Mol. Life Sci. 2007; 64(7-8): 1009-32.

36. Ponnampalam A.P., Weston G.C., Trajstman A.C., Susil B., Rogers P.A. Molecular classification of human endometrial cycle stages by transcriptional profiling. Mol. Hum. Reprod. 2004; 10(12): 879-93.

Поступила 08.09.2017

Принята в печать 22.09.2017

Об авторах / Для корреспонденции

Хириева Патимат Магомедовна, аспирант гинекологического отделения ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-77-83. E-mail: dr.khirieva@rambler.ru ORCID:0000-0002-3440-4121
Кузнецова Мария Владимировна, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических исследований ФГБУ НМИЦ АГП
им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-22-92. E-mail: mkarja@mail.ru 
Быстрицкий Андрей Александрович, к.б.н., в.н.с. лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-22-92. E-mail: andrey.bystritskiy@yandex.ru
Мартынов Сергей Александрович, д.м.н., в.н.с. гинекологического отделения ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-77-83. E-mail: s_martynov@oparina4.ru
Бурменская Ольга Владимировна, д.б.н., с.н.с. лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-22-92. E-mail: o_bourmenskaya@oparina4.ru
Трофимов Дмитрий Юрьевич, д.б.н., профессор, зав. лабораторией молекулярно-генетических методов ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова
Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-22-92. E-mail: d.trofimov@oparina4.ru
Адамян Лейла Владимировна, д.м.н., профессор, академик РАН, зам. директора по научной работе, руководитель гинекологического отделения ФГБУ НМИЦ АГП
им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-77-83. E-mail: l_adamyan@oparina4.ru

Для цитирования: Хириева П.М., Кузнецова М.В., Быстрицкий А.А., Мартынов С.А., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Адамян Л.В. Исследование уровня мРНК генов в ткани эндометрия у женщин репродуктивного возраста с внутриматочными синехиями. Акушерство и гинекология. 2018; 2: 56-64.
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2018.2.56-64

Полный текст публикаций доступен только подписчикам

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь

Статьи по теме

Наши издания