Клиническая и биологическая эффективность использования микрожидкостных чипов для селекции сперматозоидов при лечении бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий

Актуальность: В современной лаборатории вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) для обработки эякулята перед оплодотворением и выделения фракции морфологически нормальных подвижных сперматозоидов широко используются только два метода: центрифугирование в градиенте плотностей и метод «всплытия» (swim-up). Оба этих способа требуют центрифугирования образца спермы при высоких скоростях вращения (300g), что может оказывать негативное влияние на целостность ДНК мужских половых клеток, а также способствовать формированию в образце активных форм кислорода, которые могут снижать оплодотворяющую способность сперматозоидов, вызывая фрагментацию ДНК. В качестве перспективного метода селекции мужских половых клеток в программах лечения бесплодия микрофлюидные системы привлекают внимание исследователей из-за своей способности отбирать сперматозоиды с повышенным репродуктивным потенциалом. 
Цель: Оценка клинической эффективности использования микрожидкостных чипов для селекции сперматозоидов в программах лечения бесплодия методами ВРТ, а также анализ морфофункциональных характеристик мужских гамет, отобранных с помощью микрофлюидики.
Материалы и методы: В настоящее исследование были включены 94 супружеские пары, проходящие лечение бесплодия методами ВРТ, которые были разделены на две когорты: основная группа (n=47), где оплодотворение осуществляли сперматозоидами, выделенными на микрофлюидных чипах; группа сравнения (n=47), где проводили стандартную пробоподготовку эякулята в градиенте плотностей. Проводили оценку клинических и эмбриологических показателей. На втором этапе эякулят мужчин основной группы был разделен на три части: натив, группа основная (микрожидкостные чипы Fertile Plus, Турция), группа сравнения (градиент, 300g, протокол производителя, «ПанЭКО», Россия). Оценивали концентрацию (С), подвижность (PR%), морфологию (N, %) и зрелость хроматина сперматозоидов (%). Анализ сперматозоидов на ядерный белок (зрелость/конденсацию хроматина) выполняли посредством окрашивания анилиновым синим (Sperm Processor, Индия). Статистическую обработку данных проводили с помощью пакета программ SPSS Statistics (США), для выявления различий между группами применяли U-тест Манна–Уитни. Уровень p<0,05 считали пороговым.
Результаты: Оценка результатов программ ВРТ при использовании микрофлюидных технологий показала статистически значимое увеличение числа бластоцист отличного и хорошего качества на 5–6-е сутки культивирования. По частоте оплодотворения, частоте наступления клинической беременности и ранним репродуктивным потерям до 12 недель гестации группы между собой не различались. Результаты оценки биологических параметров мужских гамет на втором этапе исследования показали, что по концентрации и подвижности группы между собой не различались. Отличия по выделению морфологически нормальных сперматозоидов оказались статистически значимыми (p<0,05): натив – 2 (2; 3); основная группа (микрожидкостные чипы) – 3 (3; 4) и группа градиента (группа сравнения) – 3 (3; 3). Также значимо отличалось качество хроматина выделенных сперматозоидов: доля незрелых сперматозоидов в нативном эякуляте составляла 14% (8; 20), в группе чипов – 3% (5,5; 12) и в группе градиента – 8% (5; 10) при норме не более 15%.
Заключение: Полученные в настоящем исследовании результаты указывают на увеличение не только морфологически нормальных сперматозоидов, отобранных на микрожидкостных чипах, но и на повышение доли мужских половых клеток с нормально упакованным хроматином, что крайне важно для пролонгирования беременности, полученной в результате лечения методами ВРТ. Также возможно ожидать улучшения эмбриологических показателей при селекции сперматозоидов без центрифугирования, только с использованием устройств с микрофлюидикой (в том числе пассивной). Для оценки клинической результативности требуется дальнейший набор данных.

Вклад авторов: Макарова Н.П. – систематизация и анализ литературы, разработка концепции статьи, обработка данных, написание текста рукописи; Сысоева А.П. – проведение эмбриологического этапа программ лечения бесплодия методами ВРТ, оценка показателей оплодотворения и бластуляции, редактирование рукописи статьи; Чернышев В.С. – участие в разработке дизайна эксперимента, критические замечания к рукописи статьи; Гаврилов М.Ю. – сбор литературы, обработка эякулята на микрожидкостных чипах, анализ показателей сперматогенеза, редактирование рукописи; Лобанова Н.Н. – оценка зрелости хроматина, выполнение пробоподготовки эякулята к ДНК-фрагментации, редактирование рукописи статьи; Кулакова Е.В. – критический обзор рукописи статьи, внесение исправлений и замечаний; Калинина Е.А. – критические замечания к рукописи статьи, утверждение публикации.
Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии возможных конфликтов интересов.
Финансирование: Работа выполнена при финансовой поддержке государственного задания 2024-2026 №124020500056-7 «Разработка инновационных микрофлюидных чипов для селекции мужских половых клеток в программах лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий», руководитель Макарова Н.П.
Одобрение Этического комитета: Исследование было одобрено локальным этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.
Согласие пациентов на публикацию: Пациенты подписали информированное согласие на публикацию своих данных.
Обмен исследовательскими данными: Данные, подтверждающие выводы этого исследования, доступны по запросу у автора, ответственного за переписку, после одобрения ведущим исследователем.
Для цитирования: Макарова Н.П., Сысоева А.П., Чернышев В.С., Гаврилов М.Ю., Лобанова Н.Н., Кулакова Е.В., Калинина Е.А. Клиническая и биологическая эффективность использования микрожидкостных чипов для селекции сперматозоидов при лечении бесплодия 
методами вспомогательных репродуктивных технологий.
Акушерство и гинекология. 2024; 11: 138-145
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2024.172

С появлением технологии экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) у человека в 1978 г. врачи и исследователи с нестабильным успехом пытаются увеличить частоту наступления клинической беременности, однако и сегодня она не превышает 35–40% в расчете на перенос эмбриона в полость матки с учетом криоциклов. Становится все более понятным, что существенно повысить эффективность лечения мужского и женского бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) можно лишь на эмбриологическом этапе программы. В этой связи крайне важным является совершенствование способов отбора сперматозоидов и эмбрионов. Что касается эмбрионов, то введение методов преимплантационного генетического тестирования (ПГТ) позволяет увеличить частоту наступления беременности на 10–15%, а вот с методами селекции мужских половых клеток вопрос остается открытым и требует применения более фундаментальных технологий и междисциплинарного подхода.

В современной лаборатории ВРТ для обработки эякулята перед оплодотворением и выделения фракции морфологически нормальных подвижных сперматозоидов используются следующие методы: высокоскоростное центрифугирование в градиенте плотностей на коммерческих культуральных средах и метод «всплытия» (swim-up), когда используется гаметный буфер. Согласно протоколам работы с гаметами человека, оба метода требуют центрифугирования образца спермы при высоких скоростях (300g), что может оказывать отрицательное влияние на целостность ДНК мужских половых клеток, а также приводить к формированию в образце активных форм кислорода, которые могут снижать оплодотворяющую способность сперматозоидов, вызывая фрагментацию их ДНК [1]. В качестве перспективного метода селекции мужских половых клеток в программах лечения бесплодия микрофлюидные системы привлекают внимание врачей и исследователей из-за своей способности отбирать сперматозоиды с повышенным потенциалом к оплодотворению [2–4].

Основная идея микрожидкостного устройства для отбора мужских половых клеток заключается в сборе наиболее подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов для повышения вероятности оплодотворения, увеличения числа бластоцист хорошего качества и успешного наступления беременности. Все разработанные устройства можно разделить на две группы. Первая группа – активные микрофлюидные устройства, использующие внешние силы, такие как оптические ловушки, электрофорез и гидростатическое давление [5]. К сожалению, названные методы не подходят для выделения пригодных для ЭКО сперматозоидов, поскольку являются слишком инвазивными. Кроме того, для применения этих активных методов требуются сложные экспериментальные установки, что делает их трудоемкими и длительными. Во второй категории – пассивных микрофлюидных системах – процесс разделения основан на присущем сперматозоидам поведении, таком как «следование за границей разделения сред» и «реакция на внешние стимулы», такие как поток жидкости, температура и химические градиенты [1]. Пассивные системы могут разделять сперматозоиды без нарушения их морфологии и целостности ДНК, имитируя среду in vivo, что позволяет отбирать лучшие и наиболее компетентные сперматозоиды [6].

В настоящее время для использования в клинической практике на территории России разрешены микрожидкостные чипы FertilСhip турецкого производства. Именно они были использованы в текущем исследовании. В статье Aydin S. и Eflatun Deniz M. (2022) было показано, что технология отбора сперматозоидов на основе микрофлюидных жидкостей позволяет выбирать сперматозоиды с меньшим количеством повреждений ДНК [2]. Согласно результатам исследования, показатели оплодотворения и качества эмбрионов были сопоставимы в группах с использованием чипа и при стандартной обработке сперматозоидов на градиенте плотностей. При этом в исследуемой группе наблюдалось большее количество живорождений, имплантаций и клинических беременностей. Это может свидетельствовать о том, что с помощью Fertile Chip была отобрана сперма более высокого качества или что другие параметры, влияющие на качество эмбрионов, не отражаются в морфологии сперматозоидов [2].

В связи с вышесказанным целью настоящего исследования явилась оценка клинической эффективности использования микрожидкостных чипов для селекции сперматозоидов в программах лечения бесплодия методами ВРТ, а та...

Макарова Н.П., Сысоева А.П., Чернышев В.С., Гаврилов М.Ю., Лобанова Н.Н., Кулакова Е.В., Калинина Е.А.