Количественный анализ piwiРНК в среде культивирования эуплоидных и анеуплоидных бластоцист как вспомогательный способ отбора качественного эмбриона для переноса в полость матки в программах вспомогательных репродуктивных технологий

Цель: Идентификация молекул piwiРНК в среде культивирования бластоцисты, ассоциированных с плоидностью клеток и способностью эмбриона к имплантации после переноса в полость матки.
Материалы и методы: В исследование включены 73 супружеские пары, у которых была проанализирована среда культивирования 93 эмбрионов, среди которых 53 бластоцисты были эуплоидными (по результатам ПГТ-А) с наличием (27 эмбрионов) и отсутствием (26 эмбрионов) имплантации после криопереноса в полость матки в программах ВРТ с использованием циклической гормональной терапии и 40 бластоцист были анеуплоидными. Молекулы piwiРНК, выделенные из 20 мкл среды культивирования набором miRNeasy Serum/Plasma Kit (Qiagen), были проанализированы методом глубокого секвенирования на платформе NextSeq 500/550 (Illumina, USA) c последующей валидацией полученных данных методом количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени наборами miScript II RT Kit и miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Hilden, Germany).
Результаты: Получены 2 модели логистической регрессии по количественной оценке hsa_piR_020497 и hsa_piR_020829 либо hsa_piR_016677 и hsa_piR_020829, обладающие 93 и 100% специфичностью соответственно, при идентификации эуплоидной бластоцисты с высоким имплантационным потенциалом. При использовании алгоритма miRanda проанализированы потенциальные гены-мишени ассоциированных с анеуплоидией молекул piwiРНК, которые участвуют в формировании веретена деления, образовании и функционировании кинетохора, цитокинезе.
Заключение: Разработан неинвазивный метод отбора эуплоидного эмбриона с высоким имплантационным потенциалом для переноса в полость матки в программах ВРТ, который на данном этапе исследования является вспомогательным, но не альтернативным методу ПГТ-А.

Вклад авторов: Тимофеева А.В. – получение экспериментальных данных, написание статьи; Федоров И.С. – получение экспериментальных данных и их статистическая обработка; Савостина Г.В. – сбор образцов среды культивирования бластоцисты, создание клинической базы пациенток, написание статьи; Екимов А.Н. – преимплантационное генетическое тестирование эмбрионов на анеуплоидии; Перминова С.Г. – редактирование статьи.
Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии возможных конфликтов интересов.
Финансирование: Работа выполнена при финансовой поддержке Государственного задания «Решение проблемы бесплодия в современных условиях путем разработки клинико-диагностической модели бесплодного брака и использования инновационных технологий в программах вспомогательной репродукции», регистрационный номер 22-A21.
Одобрение Этического комитета: Исследование было одобрено локальным Этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России.
Согласие пациентов на публикацию: Пациенты подписали информированное согласие на публикацию своих данных.
Обмен исследовательскими данными: Данные, подтверждающие выводы этого исследования, доступны по запросу у автора, ответственного за переписку, после одобрения ведущим исследователем.
Для цитирования: Тимофеева A.В., Федоров И.С., Савостина Г.В., Екимов А.Н., Перминова С.Г. Количественный анализ piwiРНК в среде культивирования эуплоидных и анеуплоидных бластоцист как вспомогательный способ отбора качественного эмбриона для переноса в полость матки в программах вспомогательных репродуктивных технологий. Акушерство и гинекология. 2023; 11: 115-130
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2023.180

На положительный исход программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) влияет множество факторов, среди которых ключевыми являются качественный эмбрион, рецептивный эндометрий и установление «диалога» между ними [1, 2]. Однако далеко не во всех случаях перенос эмбриона хорошего качества в полость матки в соответствующей фазе менструального цикла приводит к наступлению беременности [3]. Значительный вклад в этиологию неудач имплантации и ранних репродуктивных потерь беременности вносят хромосом­ные аномалии эмбрионов. Известно, что более половины случаев ранних репродуктивных потерь беременности ассоциированы с анеуплоидными эмбрионами [4]. А частота образования эмбрионов с хромосомными аномалиями имеет устойчивую корреляцию с возрастом женщины. Так, если у женщин в возрасте 26–30 лет доля анеуплоидных эмбрионов составляет 20–27%, то в возрасте 45 лет 95,5% эмбрионов имеют хромосомные аномалии [5, 6]. Учитывая современную тенденцию к более позднему деторождению, образование анеуплоидных эмбрионов имеет критически важное значение, а возможность выявления эмбрионов с хромосомными аномалиями на доимплантационном этапе особенно актуальна.

Используемые в клинической практике визуальные методы оценки качества эмбрионов не отражают хромосомный статус и не исключают переноса анеуплоидного эмбриона в полость матки [7]. Около 44,5% анеуплоидных бластоцист имеет нормальное морфологическое строение [8]. Единственным на сегодняшний день методом оценки плоидности эмбрионов в клинической практике является преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (ПГТ-А). Внедрение ПГТ-А позволило снизить вероятность переноса анеуплоидного эмбриона в полость матки, однако около 50% эуплоидных эмбрионов не имплантируются, в то время как влияние ПГТ-А на исходы программ ВРТ в различных группах пациентов является предметом дискуссий [9–13]. Помимо неоспоримых преимуществ, ПГТ-А обладает и рядом недостатков, среди которых: инвазивность, высокая стоимость и трудоемкость, а также наличие ложных результатов, которые объясняются невозможностью точного определения процента мозаичных клеток в эмбрионе на основании анализа лишь нескольких клеток трофэктодермы [14].

Одним из наиболее перспективных направлений репродукции является изучение роли посттранскрипционных регуляторов экспрессии кодирующих белок генов в эмбриогенезе и возможности использования их в качестве биомаркеров качества эмбрионов. Среди них основное место занимают малые некодирующие РНК [15–17], среди которых самым многочисленным классом у человека являются piwiРНК (8438265 видов молекул согласно базе данных piRBase v.2.0) в сравнении с микроРНК (2600 разновидностей молекул согласно miRBase v.22). Отличительной особенностью piwiРНК является регуляция стабильности генома клетки путем подавления активности мобильных генетических элементов – транспозонов [18, 19]. Существующие механизмы контроля степени экспрессии и мобилизации транспозонов тонко регулируются, особенно в клетках зародышевой линии, так как полное подавление экспрессии транспозонов препятствует нормальному развитию гамет и эмбрионов [20].

На сегодняшний день выявлены особенности экспрессии микроРНК в культуральных средах эмбрионов на разных стадиях эмбриогенеза в зависимости от плоидности их клеток, способности к имплантации и исходов программ ВРТ [21, 22]. Однако до настоящего времени роль piwiРНК в качестве маркера плоидности клеток эмбриона с целью выбора наиболее качественной бластоцисты для переноса в полость матки не была изучена, за исключением наших предыдущих исследований прогностической значимости данного класса молекул в оценке имплантационного потенциала эмбриона на стадии морулы и бластоцисты без учета кариотипа их клеток [23, 24].

В связи с этим целью настоящей работы был анализ содержания piwiРНК в среде культивирования бластоцисты с охарактеризованным кариотипом по данным ПГТ-А для идентификации молекул, ассоциированных с плоидностью клеток эмбриона, и оптимизации селективного переноса эмбриона в рамках программ ВРТ.

Материалы и методы

В исследовании участвовали 343 супружеских пары, обратившиеся для проведения программы ЭКО/ИКСИ+ПГТ-А (экстракорпоральное оплодотворение с интрацитоплазматической инъекцией сперматозоида и последующее проведение ПГТ-А) в НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова в период с 2018 по 2021 гг. Было проанализировано 400 циклов ЭКО/ИКСИ+ПГТ-А и 309 криопротоколов. Из 2046 эмбрионов 5-х суток культивирования 1115 эмбрионам было проведено ПГТ-А.

Критериями включения в исследование послужили: отсутствие наступления беременности в течение 1 года и более, нормальный кариотип супругов, наличие таких показаний для проведения ПГТ-А, как старший репродуктивный возраст женщины (35 лет и более), привычный выкидыш (2 и более самопроизвольных прерываний беременности на сроке до 22 недель в анамнезе), повторные неудачные попытки ВРТ (3 и более неудачных попыток селективного переноса «свежих» или размороженных эмбрионов) или тяжелая патозоосп...

Тимофеева A.В., Федоров И.С., Савостина Г.В., Екимов А.Н., Перминова С.Г.