Урология №5 / 2014
Маркеры для неинвазивной молекулярно-генетической диагностики онкоурологических заболеваний
ФГБУ «НИИ урологии» Минздрава России
В настоящее время накоплена масса данных о молекулярно-генетических нарушениях при раке предстательной железы (РПЖ), раке мочевого пузыря (РМП) и раке почки (РП). Опухолевые клетки при этих заболеваниях присутствуют в осадке мочи в достаточном для проведения молекулярно-генетического анализа количестве, что делает возможным развитие неинвазивной диагностики онкоурологических заболеваний. Характерной особенностью РПЖ является гиперэкспрессия гена PCA3, для количественной оценки которой уже разработан диагностический набор Progensa™, около 50% опухолей экспрессируют химерный онкоген TMPRSS2-ERG. Комбинированный анализ PCA3 и TMPRSS2-ERG позволяет выявлять РПЖ с диагностической точностью до 84%, что значительно выше, чем у теста на простатспецифичный антиген. В качестве потенциальных маркеров РМП в осадке мочи выступают соматические мутации в генах FGFR3, PIK3CA, TERT, которые при этом заболевании встречаются с частотой около 60, 30 и 50% соответственно. В основу тест-системы для ДНК-диагностики РМП по осадку мочи может быть положено определение сочетания мутаций в этих генах с микросателлитной нестабильностью. Аберрантное метилирование 5’-регуляторных районов генов-супрессоров, объединенных в панели, также рассматривается как инструмент в диагностике РП (VHL, RASSF1, RARB2, CDH1), РПЖ (GSTP1, PTGS2, LGALS3) и РМП (RASSF1, APC, SFRP2) после стандартизации панелей исследуемых локусов, методов пробоподготовки, бисульфитной конверсии, дизайна праймеров и зондов. Таким образом, уже производятся или могут быть разработаны в ближайшем будущем тест-системы для молекулярно-генетической диагностики онкоурологических заболеваний по осадку мочи.
Введение. Онкоурологические заболевания включают злокачественные новообразования различных типов и локализаций, наиболее частые из которых – рак предстательной железы (РПЖ), рак мочевого пузыря (РМП) и рак почки (РП) – входят в десятку наиболее распространенных опухолей у мужского населения России [1]. Лабораторные методы определения молекулярных маркеров этих новообразований в моче или крови в широкую клиническую практику пока не вошли. Вместе с тем накоплена масса данных о молекулярно-генетических нарушениях при РПЖ, РМП и РП, некоторые из которых могут рассматриваться в качестве потенциальных диагностических маркеров [2–4]. Часто при онкоурологиче- ских заболеваниях опухолевые клетки попадают в просвет мочевыводящих путей в достаточном для анализа количестве, и присутствующие в них генетические изменения могут быть выявлены в ДНК (РНК) из осадка мочи [5, 6]. В настоящем обзоре рассмотрены потенциальные молекулярно-генетические маркеры и подходы к их тестированию в осадке мочи в контексте развития неинвазивной диагностики РПЖ, РМП и РП.
Анализ экспрессии генов в диагностике рака предстательной железы по осадку мочи
К основным методам ранней диагностики РПЖ относят пальцевое ректальное исследование, определение уровня простатспецифичного антигена (ПСА) и трансректальное ультразвуковое исследование, из них ПСА как независимый маркер обладает большей предиктивной ценностью. Простатспецифический антиген – каллекреинподобная сериновая протеаза, продуцируемая исключительно клетками предстательной железы. Это в первую очередь органоспецифичный, но не раково-специфичный маркер: концентрация ПСА может быть повышена при гиперплазии или аденоме предстательной железы. Повышение уровня ПСА, подтвержденное при повторном анализе, может служить показанием к биопсии предстательной железы. Морфологическое исследование новообразований предстательной железы вследствие гетерогенности и мультифокальности опухолей представляет сложную задачу, решение которой требует высокой квалификации патолога. Зачастую доброкачественные гиперпластические железистые структуры соседствуют с фокусами интраэпителиальной неоплазии (ПИН) и аденокарциномой различной степени дифференцировки [7, 8]. Около 15 лет назад методом дифференциального дисплея выявили кДНК гена PCA3 (prostate cancer gene 3, ранее его называли DD3 – differential display clone 3), гиперэкспрессия которого характерна для РПЖ. Продукт гена PCA3 относится к некодирующим РНК, представлен рядом изоформ из-за альтернативного сплайсинга, разных сайтов инициации и терминации транскрипции, локализован внутри интрона 6-го гена PRUNE2, задействованного в регуляции клеточной пролиферации [9]. За последние 5 лет экспрессия гена РСА3 подверглась всестороннему изучению в качестве потенциального маркера РПЖ, в том числе в опухолевых клетках из осадка мочи. Показано, что в аденокарциноме простаты экспрессия РСА3 в 60–70 раз превышает ее уровень в морфологически не измененной ткани [10]. В некоторых работах, посвященных изучению экспрессии РСА3 в осадке мочи, анализ включил получение первой порции мочи (20–30 мл) после массажа простаты, центрифугирование, выделение тотальной РНК из клеточного осадка, обратную транскрипцию и полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени с TaqMan-зондами. В качестве калибратора выступил ген KLK3, который кодирует ПСА и характеризуется простатспецифичной экспрессией [11]. Однако более эффективный подход лежит в основе метода анализа экспрессии РСА3 в осадке мочи, разработанного компанией «DiagnoCure Inc.» (Канада). В нем РНК, выделенную из осадка мочи после массажа простаты, анализировали с помощью NASBA в реальном времени, где происходит изотермическая амплификация нуклеиновых кислот при участии обратной транскриптазы и Т7-полимеразы, а в качестве зондов используют «молекулярные маячки» (beacons). Дизайн эксперимента также предусматривал одновременную оценку уровней экспрессии целевого гена РСА3 и органоспецифичного контроля – гена KLK3, по представленности транскриптов которого осуществляли нормировку уровня экспрессии РСА3 [12]. В дальнейшем компания «Gene-Probe Inc.» (США) внесла в этот метод ряд модификаций: вместо центрифугирования мочу забирали в среду, где проводили лизис клеток и сорбцию исследуемых мРНК со специфичными олигонуклеотидами, иммобилизованными на магнитных шариках; для оценки результатов амплификации был определен пороговый уровень PCA3-Score (этот показатель равен умноженному на 103 отношению количества копий мРНК PCA3 к количеству копий мРНК KLK3), что привело к созданию диагностического набора Progensa™, предназначенного для количественного определения мРНК гена РСА3 в осадке мочи [13]. К настоящему времени неинвазивную диагностику с использованием набора Progensa™ осуществляют во многих лабораториях, появилась возможность обобщить основные преимущества, недостатки и возможные пути развития указанного метода. Во-первых, ген РСА3 гиперэкспрессируется в опухоли относительно нормальной ткани, а любой онкомаркер, концентрация которого п...
