Механизм стимуляции ангиогенеза в ишемизированном миокарде с помощью стромальных клеток жировой ткани

Стромальные клетки из подкожной жировой ткани (СКЖТ) являются перспективными для клеточной терапии ишемических состояний в силу способности стимулировать рост сосудов. Для выявления механизмов ангиогенного действия СКЖТ мы использовали модель со культивирования СКЖТ с клетками, выделенными из постнатальных сердец (фракция кардиомиоцитов — КМЦ). Фракция КМЦ содержит зрелые кардиомиоциты, эндотелиальные и прогениторные клетки. На 2 й день в культуре КМЦ формируются спонтанно бьющиеся колонии КМЦ с отрастающими от них CD31 позитивными капилляроподобными структурами. Наблюдаемые структуры нестабильны и разбираются через 5 дней культивирования. При со культивировании КМЦ с СКЖТ наблюдается формирование стабильных, разветвленных CD31 позитивных структур. Используя метод со культивирования КМЦ с СКЖТ, обработанными митомицином С, и метод иммуномагнитной деплеции для удаления эндотелиальных клеток из фракции КМЦ, мы обнаружили, что СКЖТ стимулируют формирование капилляроподобных структур за счет секреции ангиогенных факторов, стабилизации формирующихся CD31 позитивных структур за счет межклеточных контактов и стимуляции эндотелиальной дифференцировки прогениторных клеток, присутствующих во фракции КМЦ.

Строма жировой ткани содержит популяцию прогениторных клеток CD34+, локализованных периваскулярно. Стромальные клетки из подкожной жировой ткани (СКЖТ) были выделены и охарактеризованы в лаборатории доктора P. Zuk [1]. СКЖТ представляют собой гетерогенную фракцию клеток, экспрессирующих маркеры CD44/Pgp-1, CD90/Thy-1, CD9, CD10, CD11b/integrin-αM, CD13, CD29/integrin-β1, CD54/ICAM-1, CD55, CD91, CD105/endoglin, CD71/TfR, CD146/Muc-18, CD166/ALCAM, и не экспрессирующих (или с низким уровнем экспрессии) маркеры CD34, CD31 (PECAM-1), CD45 [1, 2]. Эти клетки способны секретировать ангиогенные и антиапоптотические факторы, а выделенные СКЖТ поддерживают и стабилизируют капилляроподобные структуры, формирующиеся из эндотелиальных клеток in vitro и in vivo [3, 4]. На экспериментальной модели ишемии задней конечности было показано, что системное или локальное введение СКЖТ стимулирует ангиогенез и регенерацию мышечной ткани в поврежденной конечности [5]. Инъекции СКЖТ по периферии зоны инфаркта стимулируют ангиогенез в ишемизированном миокарде и способствуют уменьшению постинфарктного рубца. Тем не менее механизмы, за счет которых СКЖТ оказывают стимулирующие ангиогенные эффекты in vivo и in vitro, до сих пор в значительной степени остаются неизвестны.

Для воспроизведения сложных межклеточных взаимодействий и паракринных эффектов, характерных для клеток в тканях in vivo, мы использовали модель со-культивирования клеток, которая ранее была описана при изучении дифференцировки стволовых и прогениторных клеток в нейтральном [6—8] и гематопоэтическом направлении [9, 10], для дифференцировки фоторецепторных клеток [11], гепатоцитов [12], а также для изучения условий поддержания жизнеспособности клеток и их экспансии in vitro [4, 13, 14]. Со-культивирование клеток представляет собой удобную модель для изучения сложных процессов ангиогенеза в контролируемых условиях, приближенных к условиям in vivo.

В настоящей работе, используя модель со-культивирования СКЖТ с клетками фракции кардиомиоцитов (КМЦ), выделенными из ранних постнатальных сердец крыс, мы показали, что СКЖТ стимулируют образование стабильных капилляроподобных структур. Наблюдаемые эффекты лишь частично обусловлены секрецией ангиогенных и антиапоптотических факторов, важную роль в формировании стабильных капилляроподобных структур играют клеточные контакты между СКЖТ и КМЦ. Кроме того, было обнаружено, что СКЖТ стимулируют образование капилляроподобных структур не только за счет эндотелиальных клеток, присутствующих во фракции КМЦ, но и за счет индукции эндотелиальной дифференцировки прогениторных клеток сердца.

Материал и методы

Выделение и культивирование СКЖТ. Выделение клеток проводили согласно ранее опубликованному протоколу [1] с некоторыми модификациями. Для получения первичной культуры клеток СКЖТ использовали взрослых самцов крыс линии Wistar. Из подкожной жировой клетчатки, расположенной по бокам в нижней части туловища или паховой области, и висцерального внутрибрюшинного жира, расположенного непосредственно под широкой мышцей живота, изолировали участки ткани (примерно 2—5 г). Выделение жира проводили в асептических условиях, с использованием кетаминового наркоза из расчета 75 мг на 1 кг веса животного.

Выделение клеток из полученного в результате операции материала осуществляли в стерильных условиях. Ткань измельчали сосудистыми ножницами до консистенции суспензии мелких (размером не более нескольких кубических миллиметров) кусочков и смешивали с растворами ферментов коллагеназы I типа (200 ед/мл, Worthington Biochemical, США) и диспазы (40 ед/мл Invitrogen Corporation, Германия) при соотношении объема ткани (в мл) к объему ферментативного раствора (в мл) 1:2. Образец инкубировали при температуре 37 °С в течение 45 мин при постоянном покачивании; по окончании инкубации к нему добавляли равный объем среды DMEM (Gibco)/10% фетальная бычья сыворотка (ФБС) (HyClone) и центрифугировали при 600 об./мин в течение 5 мин.

Белесый поверхностный слой, представленный зрелыми адипоцитами и кусочками ферментативно необработанной ткани, удаляли, а осадок, состоящий из СКЖТ, остатков соединительной ткани и клеток крови, помещали в лизирующий буфер для эритроцитов. Полученную смесь инкубировали в течение 2—3 мин при температуре 37 °С, после чего к образцу добавляли равный объем среды DMEM/10% ФБС и фильтровали через нейлоновые мембраны (BD Falcon Cell Stainer № 352340) с размером пор 40 мкм. Для очищения популяции стромальных клеток от клеток крови и клеточного дебриса на конечном этапе суспензию центрифугировали при 800 об./мин в течение 5 мин. Супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в среде MyeloCult (Stemcell, № M5300)/100 Ед/мл пенициллин/10 мкг/мл стрептомицин (GIBCO BRL). Затем клетки переносили в чашки Петри (Corning) диаметром 60 мм в количестве 1×105 клеток СКЖТ на каждую чашку и культивировали в среде MyeloCult (8 мл). На следующий день среду культивирования меняли на свежую состава DMEM/10% ФСБ /100 Ед/мл пенициллина/10 мкг/мл стрепт...

Рубина К.А., Калинина Н.И., Ефименко А.Ю., Лопатина Т.В., Мелихова В.С., Цоколаева З.И., Сысоева В.Ю., Ткачук В.А., Парфенова Е.В.