Микробиологический мониторинг Pseudomonas aeruginosa в акушерских стационарах

01.10.2013
986

Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь, Россия; ГБОУ ВПО Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера Минздрава России

Цель исследования. Мониторинг Pseudomonas aeruginosa в акушерских стационарах с учетом антибиотикорезистентности и генетического родства штаммов.
Материал и методы. Микроорганизмы выделены от здоровых новорожденных (колонизация) и в случае гнойно-септических инфекций (ГСИ) в период с января 2006 г. по октябрь 2012 г. Родство изолятов определяли с помощью молекулярно-генетических методов.
Результаты исследования. Среднемноголетний уровень инфицированности за пять лет – 7,9±5,8 на 1000 обследованных. Наиболее часто P. aeruginosae встречались в образцах мекония и желудочного сока новорожденных в случае колонизации, а также в мокроте – в случае ГСИ. Инфекция возникает чаще всего как экзогенная, обусловленная нозокомиальными штаммами, и с учетом уязвимости контингента носит вспышечный характер. Такое предположение подтверждено данными антибиотикоустойчивости изолятов и секвенирования blaOXA-50-генов.
Заключение. Наиболее значимой P. aeruginosa может быть только при инфекции дыхательных путей. Установленное единообразие blaOXA-50-генов позволило предположить формирование эпидемически значимого клона в замкнутом контуре: акушерский стационар – неонатальные отделения детской клиники.

Проблема гнойно-септических инфекций (ГСИ) особенно актуальна в неонатологии, поскольку учреждения родовспоможения лидируют в статистике внутрибольничной заболеваемости [1, 2]. В соответствие с данными микробиологических исследований происходит расширение микробного спектра за счет многочисленных представителей коагулазо-негативных Staphylococcus и Enterococcus [3–5]. В то же время вспышки ГСИ, в том числе и в отделениях интенсивной терапии новорожденных, как правило, обусловлены грамотрицательными бактериями родов Klebsiella, Proteus, Pseudomonas [6–9]. Более того, с применением антибиотиков для профилактики стрептококковой инфекции повышается риск развития септических осложнений у новорожденных, обусловленных грамотрицательными микроорганизмами [10–12].

Pseudomonas aeruginosa, не ферментирующие грамотрицательные микроорганизмы, могут быть причиной разнообразных патологических состояний у новорожденных, включая сепсис, пневмонию, менингит, диарею, конъюнктивит и инфекции кожи [13, 14]. По некоторым данным, доля Р. aeruginosa при сепсисе в неонатальном периоде может составлять до 60% [15]. Принято считать, что роль P. aeruginosa как этиопатогена при вспышках ГСИ в учреждениях родовспоможения менее значима по сравнению с другими грамотрицательными бактериями. Однако в последние годы показано, что наряду с возможным персистированием/сохранением в различных экологических резервуарах [16, 17] эти микроорганизмы быстро приобретают устойчивость к антибактериальным препаратам различных классов [18, 19]. Вместе с тем в акушерских стационарах выбор антимикробных препаратов ограничен в силу того, что некоторые из них могут оказывать на организм новорожденных токсическое действие, угнетать функцию органов кроветворения и иммунной системы. В совокупности эти факторы создают в неонатальной клинике потенциальную угрозу вовлечения P. aeruginosa в эпидемически значимые процессы.

Цель данной работы – мониторинг P. аeruginosa в акушерских стационарах с учетом антибиотикорезистентности и генетического родства штаммов.

Материал и методы исследования

На базе бактериологической референс-лаборатории г. Перми проанализированы результаты микробиологического мониторинга, проводимого в учреждениях родовспоможения. Микроорганизмы выделены от здоровых новорожденных (колонизация) и в случае ГСИ в период с января 2006 г. по октябрь 2012 г. Бактериологические исследования смывов с поверхности кожи и заушной складки, слизистой оболочки полости рта (зева) и конъюнктивы проводили согласно традиционному регламенту микробиологического исследования новорожденных. В случае ГСИ клиническим материалом служили отделяемое пупочной ранки, моча, мокрота, ликвор, кровь. Оценку антибиотикочувствительности бактерий осуществляли в соответствии с Методическими указаниями МУК 4.2.1890-04. Формирование базы данных для анализа структуры циркулирующей микрофлоры и характера ее чувствительности к антибиотикам осуществлялось с помощью программы WHONET v.5.3. Обобщены результаты микробиологического анализа 409 807 проб различного биологического материала. Эпидемиологические показатели – среднемноголетний уровень инфицированности, темп ее прироста оценивали за период 2006-2010 гг. при помощи программы EpiTrend v.1.4.1. Полученные данные обрабатывали с использованием методов вариационной статистики. При статистической обработке результатов вычисляли среднее значение и ее ошибку (М±σ).

В период 2008–2012 гг. формировали банк ДНК штаммов P. аeruginosa. Тотальную ДНК получали как описано у G.G. Stone и соавт. (1994) [20]. Генетическое типирование осуществляли посредством полимеразной цепной реакции (ПЦР) с универсальным праймером М 13 (RAPD-ПЦР) [21] и BOX-ПЦР [22]. Для амплификации гена blaOXA-50 были использованы праймеры A/AS (фрагмент 869 п.н.), предложенные D. Girlich и соавт. (2004) [23]. Условия и режимы специфической амплификации соблюдали согласно авторскому протоколу. Все праймеры были синтезированы ЗАО «Синтол» (Москва). Визуализацию полос, документирование данных и интерпретацию результатов амплификации и типирования осуществляли после окрашивания геля бромистым этидием с использованием программного обеспечения системы гель­документации BioDocAnalyze (Biometra, Германия).

Определение нуклеотидных последовательностей генов blaOXA-50 проводили c использованием набора реактивов SEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit на автоматическом секвенаторе 3500xL Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США) согласно рекомендациям производителя. Для секвенирующей ПЦР использовали те же праймеры, что и для наработки ампликонов. Поиск гомологичных нуклеотидных и аминокислотных последовательностей выполнен с использованием программы BLAST и базы данных GenBank/EMBL/DDBJ (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Далее их анализировали с использованием программ CLUSTAL X 1.83, TREECON version 1.3b. Анализ первичной структуры белков осуществляли с помощью программы Vector NTI 10 (http://www.catalog.invitrogen.com).

Результаты исследования

В Перми за 2006–2010 гг. было обследовано 113 523 новорожденных, из клинического материала которых изолировано 70 604 бактериальных и грибковых культур, в том числе 865 P. aeruginosa. Среднемноголетний уровень инфицированности P. aeruginosa составил 7,9±5,8 на 1000 обследованных. Направленность пятилетней динамики характеризовалась общей тенденцией к снижению со среднегодовым темпом прироста -7,0%. Прослеженная нами динамика показателей (рис. 1) обусловлена атипичной эпидемической ситуацией в 2008 г., когда было выявлено широкое распространение носительства P. aeruginosа среди детей в крупном акушерском стационаре города с последующим распространением в неонатальные отделения детских клиник (второй этап выхаживания новорожденных) [24].

Среднемноголетняя доля P. aeruginosа в спектре всех изолированных культур составила 1,23±0,04%. Этот показатель напрямую зависел от показателя инфицированности (рис. 1). Начиная с 2010 г. и в последние годы (2011–2012 гг.) доля P. aeruginosa составила 0,26±0,14% всех культур, и 0,39±0,16% в совокупности с другими псевдомонадами.

Встречаемость P. aeruginosa при исследовании различных материалов/биотопов существенно различалась. P. aeruginosa практически не высевали из смывов со слизистой оболочка полости рта (зева) и носа, поверхности кожи, конъюнктивы (рис. 2). Определенную настороженность вызывает высокая доля P. aeruginosa в спектре микробных культур из мекония и желудочного сока новорожденных. E. Borderon и соавт. (1990) не выявили связи ГСИ с колонизацией этими микроорганизмами гастроинтестинального тракта новорожденных [25]. Вместе с тем исследования последних лет с использованием молекулярных методов анализа позволили установить такую связь для других видов бактерий [26].

В случае ГСИ P. aeruginosa наиболее часто изолировали из мокроты, которая сохраняет свою приоритетную значимость в контексте выделения этих бактерий [27]. Удельный вес этих бактерий в ликворе составил более 6%. При этом частота встречаемости P. aeruginosa в биопробах, характеризующих раневые инфекции, инфекции мочевыделительной системы, септические состояния оказалась значительно ниже (рис. 2).

Анализ антибиотикочувствительности штаммов, выделенных от новорожденных в «спокойный» период 2006–10 гг., выявил, что доля изолятов, устойчивых к антибактериальным препаратам различных фармакологических групп, не превышала 20%, за исключением цефоперазона (рис. 3А). То есть практически все исследованные препараты обладали клинически значимой активностью.

В 2011–12 гг. устойчивость культур к антибиотикам в акушерских стационарах оставалась на традиционно низком уровне (рис. 3Б). Анализ антибиотикофенотипов P. aeruginosa, изолированных в отделениях реанимации и интенсивной терапии (ОРИТ) и «неОРИТ», не выявил существенной разницы в чувствительности этих штаммов. Изучение профиля антибиотикорезистентности во время вспышки 2008 г. показало, что более 50% штаммов проявляли устойчивость к цефепиму, около 20% – к цефтазидиму (рис. 3B). Нечувствительность к карбапенемам и амикацину также встречалась значительно чаще. Наиболее активным в отношении данной группы штаммов оказался ципрофлоксацин, к которому были чувствительны более 95% штаммов. Сравнение антибиотикограмм культур P. aeruginosа, выделенных от новорожденных в этот период, выявило, что 80,7% штаммов имели сходные фенотипические характеристики. По-видимому, ситуация осложнилась формированием и распространением госпитального штамма P. aeruginosа, что и нашло отражение в общей структуре антибиотикочувствительности культур в данный период.

Для проверки данной гипотезы методом RAPD-ПЦР и BOX-ПЦР было проведено генотипирование «вспышечных» штаммов P. aeruginosa (n=114). В результате чего подавляющее большинство (n=111) из них отнесено к 3 геномовариантам и оценены как близкородственные. Данные культуры, скорее всего, были результатом персистирования «модального» штамма в отделениях акушерского стационара и двух детских больницах. Три штамма имели отличный генетический профиль.

Для подтверждения родства изолятов дополнительно выполнена специфическая амплификация и секвенирование blaOXA-50. Такая возможность была основана на двух известных фактах: продукция данных ферментов может считаться видовым признаком P. aeruginosa, но существует более 150 различных OXA-β-лактамаз. На наш взгляд, обнаружение идентичных оксациллиназ могло послужить дополнительным критерием их родства [23].

Сравнение нуклеотидных и аминокислотных последовательностей показало, что большая часть штаммов P. aeruginosa, циркулирующих в детской клинике, имеют последовательности, на 100% идентичные гену blapoxB (blaOXA-50-like) P. aeruginosa MF 6 (GenBank AY597439.1, AAT09630.1). Геномы 2 изолятов содержали последовательность blaOXA-50I P. aeruginosa KSM PAE0922 (GenBank HQ833036.1, AEK06328.1) и одного – blaOXA-50-like P. aeruginosa P23 (GenBank GQ141728.1, ACS45294.1). Такое единообразие, учитывая вариабельность OXA-50-подобных генов, позволило предположить формирование эпидемически значимого клона в замкнутом контуре: акушерский стационар – неонатальные отделения детской клиники.

Заключение

В последние годы сформировалось представление о ведущей этиологической значимости условно патогенных бактерий в развитии внутрибольничных инфекций новорожденных. Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что P. aeruginosa не играет существенной роли ни в качестве колонизирующего микроорганизма, ни в качестве этиопатогена. Наиболее значимой P. aeruginosa может быть только в случае ГСИ дыхательных путей, при всех других воспалительных процессах ее доля меньше 10%.

С микробиологической точки зрения мы объясняем прослеженные особенности в первую очередь тем, что микробиом, формирующийся у новорожденных при благоприятных условиях, не содержит P. aeruginosa. Инфекция возникает в подавляющем большинстве случаев как экзогенная, обусловленная чаще всего нозокомиальными штаммами, и ассоциирована с резервуарами внутрибольничной среды, включая медицинский персонал [28]. С учетом уязвимости контингента она носит вспышечный характер, но благодаря жесткости требований к санитарно-эпидемическому режиму в акушерских стационарах ликвидируется в короткие сроки. Это подтверждается и анализом антибиотикорезистентности изолятов. Штаммы, выделенные от новорожденных, в значительном проценте случаев чувствительны к антибиотикам большинства групп. Исключение составляют «вспышечные» изоляты, но, учитывая кратковременность персистирования в отделении, поливалентная устойчивость у них, как правило, не формируется. Такая благоприятная ситуация в учреждениях родовспоможения свидетельствует о стабильности процессов, обеспечивающих биологическую безопасность медицинских услуг, что, как правило, предотвращает возможность формирования и распространения госпитальных штаммов P. aeruginosа среди новорожденных.

Авторы выражают благодарность Главному бактериологу г. Перми Н.С. Авдеевой, заведующей микробиологической лабораторией ООО «ПРО-МЕД» С.В. Проворовой за оказанное содействие в сборе материала и нозокомиальных культур P. aeruginosa.

Список литературы

  1. Айламазян Э.К., Кулаков В.И., Радзинский В.Е., Савельева Г.М. Акушерство. Национальное руководство. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2007. 1200с.
  2. Мясникова Е.Б., Зуева Л.П., Колосовская Е.Н. Разработка и внедрение системы инфекционного контроля в роддоме и оценка ее эффективности. В кн.: Опыт внедрения системы инфекционного контроля в лечебно-профилактических учреждениях. СПб.: ГОУ ВПО СПбГМА; 2002: 70–90.
  3. Noel G.J., Edelson P.J. Staphylococcus epidermidis bacteremia in neonates: further observations and the occurrence of focal infection. Pediatrics. 1984; 74(5): 832–7.
  4. Hira V., Sluijter M., Estevão S., Horst-Kreft D., Ott A., de Groot R., Hermans P.W., Kornelisse R.F. Clinical and molecular epidemiologic characteristics of coagulase-negative staphylococcal bloodstream infections in intensive care neonates. Pediatr. Infect. Dis. J. 2007; 26(7): 607–12.
  5. DuchonJ.,Graham I.P.,Della-Latta P., Whittier S., Carp D., Bateman D. et al. Epidemiology of enterococci in a neonatal intensive care unit. Infect. Control Hosp. Epidemiol. 2008; 29(4): 374–6.
  6. Foca M., Jakob K., Whittier S., Della Latta P., Factor S., Rubenstein D. et al. Endemic Pseudomonas aeruginosa infection in a neonatal intensive care unit. N. Engl. J. Med. 2000; 343: 695–700.
  7. Gastmeier P., Loui A., Stamm-Balderjahn S., Hansen S., Zuschneid I., Shor D. et al. Outbreaks in neonatal intensive care units – they are not like others. Am. J. Infect. Control. 2007; 35: 172–6.
  8. Toltzis P., Dul М., O'Riordan М.А.,Melnick D., Lo M., BlumerJ.Meropenem use and colonization by antibiotic-resistant Gram-negative bacilli in a pediatric intensive care unit. Crit. Care Med. 2009; 10(1): 49–54.
  9. Jefferies J.M., Cooper T., Yam T., Clarke S.C. Pseudomonas aeruginosa outbreaks in the neonatal intensive care unit: a systematic review of risk factors and environmental sources. J. Med. Microbiol. 2012; 61: 1052–61.
  10. Tosson A.M., Speer C.P. Microbial pathogens causative of neonatal sepsis in Arabic countries. J. Matern. Fetal Neonatal Med. 2011; 24(8): 990–4.
  11. Dent A., Toltzis P. Descriptive and molecular epidemiology of Gram-negative bacilli infections in the neonatal intensive care unit. Curr. Opin. Infect. Dis. 2003; 16(3): 279–83.
  12. Stoll B.J., Hansen N. Infections in VLBW infants: studies from the NICHD Neonatal Research Network. Semin. Perinatol. 2003; 27(4): 293–301.
  13. Телятицкий Н.И., Абаев Ю.К. Нозокомиальная инфекция у новорожденных детей. Медицинский журнал. 2010; 2: 27–32.
  14. Crivaro V., Di Popolo А., Caprio А., Lambiase А., Di Resta M., Borriello T. et al. Pseudomonas aeruginosa in a neonatal intensive care unit: molecular epidemiology and infection control measures. BMC. Infect. Dis. 2009; 9: 70.
  15. Newtona O., English M. Young infant sepsis: aetiology, antibiotic susceptibility and clinical signs. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 2007; 101: 959–66.
  16. Gras-Le Guen C., Lepelletier D., Debillon T., Gournay V., Espaze E., Roze J.C. Contamination of a milk bank pasteuriser causing a Pseudomonas aeruginosa outbreak in a neonatal intensive care unit. Arch. Dis. Child. Fetal Neonatal. 2003; 88: 434–5.
  17. Lauwers A.S. Neonatal infections with Pseudomonas aeruginosa associated with a water-bath used to thaw fresh frozen plasma. J. Hosp. Infect. 1998; 39: 309–14.
  18. Moniri R., Mosayebi Z., Movahedian A.H., Mousavi G.A. Emergence of multi-drug-resistant Pseudomonas aeruginosa isolates in neonatal septicemia. J. Infect. Dis. Antimicrob. Agents. 2005; 22: 39–44.
  19. Sharma M., Yadav S., Chaudhary U. Metallo-beta-lactamase producing Pseudomonas aeruginosa in neonatal septicemia. J. Lab. Physicians. 2010; 2(1): 14–6.
  20. Stone G.G., Oberst R.D., Hays S., McVey S., Chengappa M.M. Detection of Salmonella serovars from clinical samples by enrichment broth cultivation-PCR procedure. J. Clin. Microbiol. 1994; 32(7): 1742–9.
  21. Huey B., Hall J. Hypervariable DNA fingerprinting in Escherichia coli. Minisatellite probe from bacteriophage M13. J. Bacteriol. 1989; 171: 2528–32.
  22. Syrmis M.W., O’Carroll M.R., Sloots T.P., Coulter Ch., Wainwright C.E., Bell S.C. et al. Rapid genotyping of Pseudomonas aeruginosa isolates harboured by adult and paediatric patients with cystic fibrosis using repetitive-element-based PCR assays. J. Med. Microbiol. 2004; 53: 1089–96.
  23. Girlich D., Naas T., Nordmann P. Biochemical characterization of the naturally occurring oxacillinase OXA-50 of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother. 2004; 48: 2043–8.
  24. Маркович Н.И., Сергевнин В.И., Сармометов Е.В., Кузнецова М.В., Карпунина Т.И., Авдеева Н.С. и др. Вспышка синегнойной инфекции среди новорожденных в отделении реанимации и интенсивной терапии. Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2010; 3: 5–10.
  25. Borderon E., Thieffry J.C., Jamet O., Poisson D., Boisseau C., Farid I.A. Observations on the intestinal colonization by Pseudomonas aeruginosa in newborn infants. Biol. Neonate. 1990; 57(2): 88–97.
  26. Das P., Singh A.K., Pal T., Dasgupta S., Ramamurthy T., Basu S. Colonization of the gut with Gram-negative bacilli, its association with neonatal sepsis and its clinical relevance in a developing country. J. Med. Microbiol. 2011; 60(11): 1651–60.
  27. Этиология нозокомиальных пневмоний у новорожденных –результаты российского исследования. Антибиотики и химиотерапия. 2001; 46: 17–23. http://www.antibiotic.ru
  28. Zawacki A., O'Rourke E., Potter-Bynoe G., Macone A., Harbarth S., Goldmann D. An outbreak of Pseudomonas aeruginosa pneumonia and bloodstream infection associated with intermittent otitis externa in a healthcare worker. Infect. Control. Hosp. Epidemiol. 2004; 25: 1083–9.

Об авторах / Для корреспонденции

Кузнецова Марина Валентиновна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярной биологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН, доцент кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО ПГМА им. академика Е.А. Вагнера Минздрава России
Адрес: 614081, Россия, Пермь, ул. Голева, д. 13. Телефон: 8 (342) 212-44-76. E-mail: mar@iegm.ru
Карпунина Тамара Исаковна, доктор биологических наук, профессор кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО ПГМА им. академика Е.А. Вагнера Минздрава России
Адрес: 614000, Россия, Пермь, ул. Петропавловская, д. 86. Телефон: 8 (342) 236-44-85. E-mail: karpuninapsma@mail.ru
Горовиц Эдуард Семенович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО ПГМА им. академика Е.А. Вагнера Минздрава России
Адрес: 614000, Россия, Пермь, ул. Петропавловская, д. 86. Телефон: 8 (342) 236-44-85. E-mail: Eduard.gorovitz@mail.ru
Демаков Виталий Алексеевич, доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН, директор ИЭГМ УрО РАН
Адрес: 614081, Россия, Пермь, ул. Голева, д. 13. Телефон: 8 (342) 212-44-76. E-mail: demakov@iegm.ru

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь