Молекулярно-генетические методы в пренатальной диагностике хромосомных аномалий

В представленном обзоре рассматриваются современные молекулярно-генетические методы, применяемые в пренатальной диагностике – интерфазная флуоресцентная in situ гибридизация, количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция, мультиплексная лигазная цепная реакция МЛЦР, система анализа prenatal BACs-on-Beads и метод сравнительной геномной гибридизации. Методы с успехом дополняют стандартный цитогенетический анализ и преодолевают некоторые его ограничения. В представленном обзоре литературы проводится сравнительный анализ этих методов, новые возможности и ограничения. Технология методов основана на концентрации внимания в «горячих точках» хромосом, изменение в которых приводит к определенным патологическим синдромам, вводится понятие – таргентое молекулярно-генетическое кариотипирование. Обсуждается тактика генетического лабораторного исследования в пренатальной диагностике. Наряду с продвижением молекулярно-генетических методов возникает новая задача — интерпретация данных, которую еще предстоит решить ученым.

Синдромы, обусловленные аномалиями кариотипа, такими как нарушение числа хромосом (анеуплоидии) или их структуры (делеции, дупликации, инверсии и транслокации), называются хромосомными. Эти синдромы характеризуются одновременным поражением многих систем и органов, что является основной причиной инвалидности и ранней детской смертности. Чаще хромосомные синдромы не наследуются, а в 90% случаев, являются следствием новых мутаций (de novo) в половых клетках родителей. Частота хромосомных аномалий составляет 5–7 случаев на 1000 новорожденных, из них 35% приходиться на аномалию половых хромосом, до 25% – на аутосомные трисомии [1].

Основным методом диагностики хромосомных аномалий является дифференциальная окраска хромосом – GTG-кариотипирование. Технология окрашивания, первоначально предложенная Seabright (1971) [36], основана на приобретении хромосомами по всей длине поперечных светлых и темных полос при обработке трипсином с последующей окраской красителем Гимзы [3]. Данный метод, однако, малопригоден для окраски хромосом из клеток хориона, полученных прямым методом. Стабильную дифференциальную окраску таких хромосом можно получить c помощью флуорохрома Hechst33258/AcD [2]. Этот метод позволяет провести анализ всего кариотипа, выявить ряд хромосомных синдромов, вызванных нарушением числа целых хромосом (анеуплоидия), идентифицировать хромосомные перестройки или мозаицизм (аномальный клеточный клон) и его доли в организме под световым микроскопом, разрешающая способность которого равна приблизительно 5Mb (5–10 млн пар нуклеотидов) [10].

Главным условием цитогенетической диагностики является получение делящихся клеток после 7–14 сут культивирования клеток или через 2–5 дней при наличии митозов в ворсинках хори-она [13, 14, 18].

Однако разрешающая возможность микроскопа не может выявить размеры перестроек от 1 до 5 Mb, т.е. микроделеций, возникающих вследствие потери групп генов в рамках одного хромосомного сегмента [40]. Для определения микроделеций применяют молекулярно-цитогенетические методы, отличающиеся более высокой разрешающей способностью.

В конце прошлого века появились молекулярно-цитогенетические методы, которые преодолевают некоторые ограничения GTG-кариотипирования. Проведение анализа данными методами возможно на небольшом числе клеток без культивирования или их ДНК [31]. Разрешающая возможность этих методов определяется минимальным размером последовательности хромосомной ДНК (числом нуклеотидов), которую возможно регистрировать с помощью высокоразрешающей оптической или автоматизированной систем детекции и анализировать с помощью специализированной компьютерной программы.

Молекулярно-цитогенетические методы широко применяются при невозможности проведения GTG-кариотипирования клеток с низкой пролиферативной активностью, для быстрого выявления или уточнения определенных (таргетных) хромосомных патологий в пренатальной диагностике. Эти методы применяются в онкоцитогенетических исследованиях для выявления хромосомного маркера, прогнозирования и мониторинга онкологических заболеваний, в предимплантационной диагностике и в педиатрии, у детей с врожденными пороками и/или задержкой умственного развития [5, 19, 32, 42, 43].

Во всем мире в настоящее время для пренатальной диагностики применяются следующие перспективные молекулярно-цитогенетические методы:

• интерфазная флуоресцентная in situ гибридизация (FISH-метод) [38];

• количественная флуоресцентная полимеразная цепная реакция КФ-ПЦР (QF-PCR) [28];

• мультиплексная лигазная цепная реакция МЛЦР (MLPA) [30];

• система анализа prenetal BACs-on-Beads (BoBs) [12, 23];

• метод сравнительной геномной гибридизации СГГ (CGH) [20, 21] (табл. 1).

Цель обзора состоит в анализе различных молекулярно-цитогенетических методов в пренатальной диагностике анеуплоидий, мозаицизма, микроделеционных синдромов.

Метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) позволяет исследовать как метафазные хромосомы, так и интерфазные клетки. Метод основан на реакции гибридизации специально созданных флуоресцентных ДНК – (зондов) с известной уникальной ДНК последовательностью в определенном комплементарном районе исследуемой хромосомы. ДНК-проба (зонд) – это фрагмент или фрагменты нуклеиновых кислот, меченые таким образом, чтобы было возможно проведение их детекции после гибридизации in situ [8]. Визуальная оценка результатов гибридизации специалистом-исследователем базируется на наличии флуоресцентного сигнала в изучаемом районе хромосомы и сравнен...

Буяновская О.А., Глинкина Ж.И., Каретникова Н.А., Бахарев В.А.