Неинвазивная пренатальная диагностика анеуплоидий методом высокопроизводительного секвенирования (NGS) в группе женщин высокого риска

27.04.2015
1432

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии  им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, Москва

Цель исследования. Оценить возможность применения метода высокопроизводительного секвенирования для неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий плода.
Материал и методы. В исследование включены 200 женщин в сроке беременности 10–20 недель (медиана – 14 недель). Результаты неинвазивной пренатальной диагностики оценивали с помощью биоинформатической обработки данных секвенирования ДНК, выделенной из плазмы крови беременных женщин, для сравнения покрытия внутри образца применяли T-test. В качестве метода сравнения использовали цитогенетическое исследование – G-окрашивание клеток ворсин хориона, плаценты, амниотической жидкости по стандартному протоколу.
Результаты. При сравнении с инвазивной пренатальной диагностикой были получены идентичные результаты в 196 случаях из 200. Достоверно определены 17 из 19 образцов с трисомией 21, 8 из 8 образцов с трисомией 18, 1 образец с трисомией 16, 1 образец с трисомией 13 и 4 из 4 образцов с моносомией X. Ложноотрицательные результаты (2 образца с трисомией 21) были получены для образцов с низким содержанием фетальной ДНК, а два ложноположительных результата – 1 по трисомии 13 и 1 по моносомии Х, вероятно, были обусловлены плацентарным мозаицизмом.
Заключение. Учитывая полученную высокую чувствительность и специфичность для оценки анеуплоидий по 21-й, 18-й и X хромосомам, а также определения пола плода (наличие хромосомы Y), данный тест может быть рекомендован для пренатального скрининга.

Хромосомные аномалии (ХА), в частности, анеуплоидии по 21-й и 18-й хромосомам, являются одной из ведущих причин перинатальной смертности и детской инвалидности в развитых странах (Информационный бюллетень ВОЗ № 370). Исследования последних лет показали, что анеуплоидии являются причиной около 60,0% спорадических выкидышей [1]. Анеуплоидная беременность часто сопровождается угрожающим выкидышем, неоднократными кровотечениями, заканчивается преждевременными родами. Инвазивные методы пренатальной диагностики в подобных клинических ситуациях противопоказаны.

Существующий на современном этапе скрининг беременных основывается на данных ультразвукового исследования, определении материнских сывороточных маркеров, компьютерного анализа. На основании результатов скрининга выделяют женщин группы высокого риска, которым показано инвазивное обследование (Приказ Минздрава России от 12 ноября 2012г. № 572н). Инвазивные процедуры – биопсия ворсин хориона, амниоцентез, реже кордоцентез, с последующим цитогенетическим исследованием являются диагностическим «золотым» стандартом. Проведение инвазивных процедур требует тщательного учета противопоказаний, в связи с риском развития осложнений вплоть до самопроизвольного прерывания беременности в 1–2% случаев. Вместе с тем, только однозначный результат обследования на наличие анеуплоидии плода позволяет определить рациональную тактику ведения осложненной беременности. После открытия явления циркуляции в материнском кровотоке ДНК плода [2] был разработан и в последние годы активно внедряется метод неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий (Non Invasive Prenatal Test – NIPT), доступный начиная с 10–11-й недели беременности [3–5]. Одним из немногих ограничений NIPT на сегодняшний день является высокая стоимость теста, от 460 евро (373 фунтов) за одно исследование [3, 4, 6]. Однако разработка отечественных тест-систем на основе высокопроизводительного секвенирования (NGS-next-generation sequencing) может существенно снизить стоимость анализа.

Таким образом, цель настоящего исследования – оценить возможность применения метода высоко­производительного (полупроводникового) секвенирования для неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий плода.

Материал и методы исследования

Обследованы 200 женщин с высоким риском хромосомной патологии плода, обусловленным возрастом беременной, изменениями в уровнях сывороточных маркеров, особенностями фенотипа плода. Обследование было проведено в сроках беременности от 10 до 20 недель (медиана – 14 недель) и включало: скрининг I и II триместров беременности – эхография, определение содержания сывороточных маркеров, компьютерный анализ; инвазивные процедуры; цитогенетическое исследование. Внутриматочные вмешательства с целью получения хориона, плаценты, амниотической жидкости выполняли в 11–14 недель (n=120) или в 17–20 недель (n=80) в связи с противопоказаниями к проведению в ранние сроки беременности или поздним обращением женщины. У всех женщин было получено согласие на инвазивную пренатальную диагностику (биопсия ворсин хориона, плаценты, амниоцентез) и получение крови из вены для молекулярного анализа. Перед проведением инвазивной пренатальной диагностики у женщин из периферической вены аспирировали 10,0 мл крови в 2 пробирки с ЭДТА.

Полученный материал анализировали с помощью цитогенетического и молекулярно-генетического методов. Кариотип плода устанавливали с помощью цитогенетического исследования (G-окрашивание) клеток ворсин хориона, плаценты, амниотической жидкости по стандартному протоколу [7]. В периферической крови женщины определяли наличие или отсутствие у плода анеуплоидий, а также его пол следующим образом. На перв...

Список литературы

  1. Gardner R., Sutherland G., Shaffer L.G., eds. Chromosome abnormalities and genetic counseling. Oxford University Press Inc.; 2011. 648 p.
  2. Казаков В.И., Божков В.М., Линде В.А., Репина М.А., Михайлов В.М. Внеклеточная ДНК в крови беременных женщин. Цитология. 1995; 37(3): 232-6.
  3. Fauzdar A. Non-invasive prenatal testing (NIPT): a better option for patients Mol. Cytogenet. 2014; 7(Suppl.1): I17.
  4. Ong F.S., Lin J.C., Das K., Grosu D.S., Fan J.B. Translational utility of next-generation sequencing. Genomics. 2013; 102(3): 137-9.
  5. Gregg A.R., Gross S.J., Best R.G., Monaghan K.G., Bajaj K., Skotko B.G. et al. ACMG statement on noninvasive prenatal screening for fetal aneuploidy. Genet. Med. 2013; 15(5): 395-8.
  6. Neyt M., Hulstaert F., Gyselaers W. Introducing the non-invasive prenatal test for trisomy 21 in Belgium: a cost-consequences analysis. BMJ Open. 2014; 4(11): e005922.
  7. Ambulkar P.S., Ghosh S.K., Ingole I.V., Pal A.K. Genotoxic and cytotoxic effects of antibacterial drug, ciprofloxacin, on human lymphocytes in vitro. Nepal Med. Coll. J. 2009; 11(3): 147-51.
  8. Bianchi D.W., Parker R.L., Wentworth J., Madankumar R., Saffer C., Das A.F. et al. DNA sequencing versus standard prenatal aneuploidy screening. N. Engl. J. Med. 2014; 370(9): 799-808.
  9. Tabor A., Alfirevic Z. Update on procedure-related risks for prenatal diagnosis techniques. Fetal Diagn. Ther. 2010; 27(1): 1-7.
  10. Qi Q.W., Jiang Y.L., Zhou X.Y., Liu J.T., Yin J., Bian X.M. Genetic counseling, prenatal screening and diagnosis of Down syndrome in the second trimester in women of advanced maternal age: a prospective study. Chin. Med. J. 2007; 126(11): 2007-10.
  11. Jeon Y.J., Zhou Y., Li Y., Guo Q., Chen J., Quan S. et al. The feasibility study of non-invasive fetal trisomy 18 and 21 detection with semiconductor sequencing platform. PLoS One. 2014; 9(10): e110240.
  12. Thung D.T., Beulen L., Hehir-Kwa J., Faas B.H. Implementation of whole genome massively parallel sequencing for noninvasive prenatal testing in laboratories. Expert Rev. Mol. Diagn. 2015; 15(1): 111-24.
  13. Баранов В.С., Айламазян Э.Л. Прикладное и фундаментальное направления пренатальной диагностики. Журнал акушерства и женских болезней. 2012; 61(3): 54-60.
  14. Lim J.H., Kim M.H., Han Y.J., Lee da E., Park S.Y., Han J.Y. et al. Cell-free fetal DNA and cell-free total DNA levels in spontaneous abortion with fetal chromosomal aneuploidy. PLoS One. 2013; 8(2): e56787.
  15. Ashoor G., Syngelaki A., Wang E., Struble C., Oliphant A., Song K., Nicolaides K.H. Trisomy 13 detection in the first trimester of pregnancy using a chromosome-selective cell-free DNA analysis method. Ultrasound Obstet. Gynecol. 2013; 41(1): 21-5.
  16. Shi X., Zhang Z., Cram D.S., Liu C. Feasibility of noninvasive prenatal testing for common fetal aneuploidies in an early gestational window. Clin. Chim. Acta. 2015; 439: 24-8.
  17. Ashoor G., Syngelaki A., Poon L.C., Rezende J.C., Nicolaides K.H. Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11-13 weeks’ gestation: relation to maternal and fetal characteristics. Ultrasound Obstet. Gynecol. 2013;41(1): 26-32.
  18. McCullough R.M., Almasri E.A., Guan X., Geis J.A., Hicks S.C., Mazloom A.R. et al. Non-invasive prenatal chromosomal aneuploidy testing—clinical experience: 100,000 clinical samples. PLoS One. 2014;9(10): e109173.
  19. Dan S., Wang W., Ren J., Li Y., Hu H., Xu Z. et al. Clinical application of massively parallel sequencing-based prenatal noninvasive fetal trisomy test for trisomies 21 and 18 in 11,105 pregnancies with mixed risk factors. Prenat. Diagn. 2012; 32(13): 1225-32.
  20. Wang E., Batey A., Struble C., Musci T., Song K., Oliphant A. Gestational age and maternal weight effects on fetal cell-free DNA in maternal plasma. Prenat. Diagn. 2013; 33(7): 662-6.
  21. Smith M., Lewis K.M., Holmes A., Visootsak J. A case of false negative NIPT for Down syndrome-lessons learned. Case Rep. Genet. 2014; 2014:823504.
  22. Zhang H., Gao Y., Jiang F., Fu M., Yuan Y., Guo Y. et al. Noninvasive prenatal testing for trisomy 21, 18 and 13 – clinical experience from 146,958 pregnancies. Ultrasound Obstet. Gynecol. 2015; Jan 19. doi: 10.1002/uog.14792.
  23. Pan Q., Sun B., Huang X., Jing X., Liu H., Jiang F. et al. A prenatal case with discrepant findings between non-invasive prenatal testing and fetal genetic testings. Mol. Cytogenet. 2014; 7: 48.
  24. Bianchi D.W., Platt L.D., Goldberg J.D., Abuhamad A.Z., Sehnert A.J., Rava R.P. Genome-wide fetal aneuploidy detection by maternal plasma DNA sequencing. Obstet. Gynecol. 2012; 119(5): 890-901.
  25. American College of Obstetricians and Gynecologists. ACOG Practice Bulletin No. 88, December 2007. Invasive prenatal testing for aneuploidy. Obstet. Gynecol. 2007; 110(6): 1459-67.
  26. Norton M.E., Jelliffe-Pawlowski L.L., Currier R.J. Chromosome abnormalities detected by current prenatal screening and noninvasive prenatal testing. Obstet. Gynecol. 2014; 124(5): 979-86.
  27. Fu W., Lu J., Xu L., Zheng L., Zhang Y., Zhong Y. et al. Applied research of combined G-banding and array-CGH in the prenatal diagnosis of ultrasonographic abnormalities in fetuses. Zhonghua Yi Xue Yi Chuan Xue Za Zhi. 2014; 31(6): 737-42.

Об авторах / Для корреспонденции

Сухих Геннадий Тихонович, д.м.н., профессор, академик РАН, директор ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-18-00. E-mail: g_sukhikh@oparina4.ru
Каретникова Наталия Александровна, в.н.с. лаборатории репродуктивной генетики ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-24-11. E-mail: n_karetnikova@oparina4.ru
Шубина Екатерина Сергеевна, м.н.с. лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. E-mail: e_shubina@oparina4.ru
Баранова Елена Евгеньевна, врач-генетик лаборатории репродуктивной генетики ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-24-11. E-mail: e_baranova@oparina4.ru
Коростин Дмитрий Олегович, м.н.с. лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. E-mail: d.korostin@gmail.com
Екимов Алексей Николаевич, врач клинической лабораторной диагностики лаборатории молекулярно-генетических методов НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. E-mail: a_ekimov@oparina4.ru
Парсаданян Нанэ Геворковна, аспирант, 2-е отделение акушерское патологии беременности ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (926) 330-42-41
Гус Александр Иосифович, зав. отделением ультразвуковой и функциональной диагностики ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. E-mail: a_gus@oparina4.ru
Бахарев Владимир Анатольевич, зав. лабораторией репродуктивной генетики ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-24-11. E-mail: v_bakharev@oparina4.ru
Трофимов Дмитрий Юрьевич, д.б.н., зав. лабораторией молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. E-mail: d_trofimov@oparina4.ru
Воеводин Сергей Михайлович, д.м.н., руководитель отдела визуальной диагностики ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. E-mail: s_voevodin@oparina4.ru
Тетруашвили Нана Картлосовна, д.м.н., зав. 2-м отделением акушерским патологии беременности ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-14-77. E-mail: n_tetruashvili@oparina4.ru

Полный текст публикаций доступен только подписчикам

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь