Неинвазивная пренатальная диагностика анеуплоидий плода, основанная на секвенировании внеклеточной ДНК крови беременной женщины

Обзор посвящен различным подходам к неинвазивной пренатальной диагностики методом высокопроизводительного секвенирования. Приведены основные принципы, возможности, преимущества и недостатки как полногеномного, так и таргетного подхода. Описаны результаты работ, опубликованных за последние 4 года, в которых определяются чувствительность и специфичность тестов и проводится сравнение с общепринятыми методами. Описываются технические и биологические ограничения метода и обсуждается целесообразность его использования как диагностического и скринингового.

Хромосомные анеуплоидии являются одной из основных причин перинатальной смертности и детской инвалидности [1]. По статистике Всемирной организации здравоохранения, с диагнозом «синдром Дауна» (наиболее распространенной трисомией плода по 21-й хромосоме) рождается каждый 700-й младенец в мире [2]. Эта частота практически не зависит от страны, климатической зоны или социального статуса. По статистике Министерства Здравоохранения, в России ежегодно рождаются около 2500 детей с трисомией 21-й хромосомы; среди детей 0–14 лет наблюдается около 10 тысяч человек больных синдромом Дауна [3]. Совершенствование методов параллельного секвенирования в совокупности с открытием свободноциркулирующей ДНК плода в кровотоке матери позволило разработать принципиально новую методику пренатальной диагностики трисомий плода, сочетающей в себе высокую точность с безопасностью как для матери, так и для ребенка [4].

В настоящий момент в России стандартной практикой выявления трисомий плода являются двухэтапные обследования: неинвазивная пренатальная диагностика (ультразвуковое исследование (УЗИ) и биохимический анализ крови) и, при необходимости, инвазивное тестирование [5]. УЗИ в сочетании с биохимическим анализом крови беременной позволяет сформировать группу риска женщин с подозрением на наличие анеуплоидии у плода. Точность данной группы методов составляет 60–70% [6]. Беременным, попавшим в группу риска, а также беременным в возрасте от 35 лет рекомендуется проведение дополнительного инвазивного исследования (биопсия хориона, амниоцентез, кордоцентез) [7]. Инвазивные процедуры предполагают кариотипирование полученных тканей плода, являющееся основным методом для прямого определения наличия трисомии как в пренатальной, так и в постнатальной диагностике [8].

В то же время получение тканей плода несет с собой высокие риски незапланированного прерывания беременности [9–11]. Статистика, собранная в Дании с 1996 по 2006 год по более чем 63 тыс. случаев проведения амниоцентеза и биопсии хориона, показала, что частота выкидышей после процедуры составила 1,4% для амниоцентеза и 1,9% для биопсии хориона [12]. Такая высокая вероятность неблагоприятного исхода становится серьезным аргументом для отказа от проведения инвазивных процедур. Поэтому разработка нового метода анализа анеуплоидий плода, с одной стороны абсолютно безопасного, с другой стороны обладающего достаточно высокой точностью, критически необходима.

Внеклеточная ДНК

Для разработки высокоточного прямого метода неинвазивной диагностики необходимо найти возможность получения генетического материала плода, не причиняя ему вреда. Было показано присутствие клеток плода в кровотоке матери, однако клетки плода встречаются крайне редко (1:100,000 материнских клеток), и к тому же могут оставаться там продолжительное время после беременности, что снижает чувствительность диагностики при повторной беременности [13]. Альтернативой использованию геномной ДНК клеток плода из кровотока матери стало использование внеклеточной ДНК (вкДНК) плазмы материнской крови. В 1997 году Lo с соавт. обнаружили присутствие в крови матери, помимо собственной материнской вкДНК (вкДНКм), плодной вкДНК (вкДНКпл) [14].

Годом позже была показана возможность использования вкДНКпл для анализа резус-фактора плода [15]. Количественный анализ показал, что относительная концентрация вкДНК плода в сыворотке крови матери значительно выше, чем относительная концентрация геномной ДНК плода в клеточной фракции [13, 16].

В среднем вкДНКпл составляет 10–12% общей вкДНК в крови матери [17]. Фрагменты вкДНКпл равномерно представляют геном плода и выводятся из организма матери вскоре после родов [18]. Это позволило предположить, что вкДНК плода в материнской плазме крови может стать отличным материалом для неинвазивной пренатальной диагностики.

Характеристика вкДНК

ВкДНК представлена фрагментами двухцепочечной ДНК, не связанными с клетками в плазме или сыворотке крови человека [19]. Присутствие в крови внеклеточных или циркулирующих нуклеиновых кислот впервые было показано в 1948 году Mandel и Metias [20]. В последующие годы были представлены работы, показавшие увеличение концентрации вкДНК в сыворотке крови больных раком и показавшие, что ее источником могут быть опухолевые клетки [21, 22], причем изменение концентрации вкДНК может быть ассоциировано с развитием онкологических заболеваний [19]. Кроме того, изменение концентрации вкДНК может быть связано с травмами, сепсисом, инсультом, инфарктом миокарда и, наконец, беременностью [23, 24].

ВкДНК попадает в кровь в результате апоптоза, дифференциации эритроцитов и тромбоцитов, иногда в результате активной секреции клетками (например, гемопоэтические клетки активно секретируют фрагменты ДНК, которые могут выполнять регуляторную функцию межклеточного общения) [19]. Возможно также, что незначительная ее часть возникает в результате некроза [25].

Интересен вопрос удаления вкДНК из крови. Наряду с предположением об элиминации вкДНК клетка...

Пантюх К.С., Шубина Е.С.