Обнаружение рака предстательной железы масс-спектрометрическим профилированием низкомолекулярного протеома плазмы крови

В настоящее время отсутствуют надежные биомаркеры плазмы крови для раннего обнаружения рака предстательной железы (РПЖ) – одной из наиболее распространенных злокачественных опухолей у мужчин. В данном исследовании разработана, унифицирована и апробирована новая методология поиска биомаркеров РПЖ – профилирование низкомолекулярного протеома плазмы крови (1–17 кДа). Данный подход включил три основных компонента: предварительную подготовку образцов, времяпролетную масс-спектрометрию с активированной матрицей лазерной десорбцией/ ионизацией ALDI-TOF-MS, обработку данных с помощью биоинформационного пакета программ. Продемонстрированы возможности и перспективность разработанного подхода к обнаружению потенциальных маркеров РПЖ. Проведен скрининг 46 образцов плазмы крови больных РПЖ и 26 контрольных образцов. В результате проведенного исследования обнаружены пептиды/полипептиды, которые могут в перспективе использоваться в качестве детектирования этого заболевания.

Введение. В развитых странах рак предстательной железы (РПЖ) является второй по частоте диагностируемой злокачественной опухолью и третьей среди причин смерти от рака у мужчин [1]. С учетом неблагоприятного прогноза запущенного РПЖ лечение на ранних стадиях может препятствовать прогрессированию небольшой локальной карциномы до большого метастатического поражения, способствуя снижению числа смертельных исходов. Введение в клиническую практику теста на простатспецифический антиген (ПСА) в сыворотке крови способствовало повышению выявляемости РПЖ. Однако зачастую тест дает ложноположительные и ложноотрицательные результаты [2], особенно в так называемой серой зоне (4–10 нг/мл), когда затруднена дифференцировка РПЖ от аденомы предстательной железы (АПЖ), простатита, при которых часто
увеличивается уровень ПСА в сыворотке крови. Выполнение пациентам манипуляций на простате и
уретре также могут повышать уровень этого маркера [3]. В то же время отмечено значительное количество диагностированных случаев РПЖ при уровне ПСА ниже 4 нг/мл (около 20–30%) [4].

Все это диктует необходимость поиска новых маркеров для улучшения ранней диагностики РПЖ
и уменьшения необходимости проведения биопсий предстательной железы. Новой парадигмой
для увеличения чувствительности и специфичности диагностических тестов становится использование
комбинации нескольких маркеров. В связи с этим наблюдается повышенный интерес к применению
протеомики в исследовании в области клинической диагностики и прогностической медицины. Одна из
основных целей протеомики – поиск и идентификация белков, дифференциально экспрессированных
(ДЭ) в биообразцах, полученных от больных и здоровых индивидов.

Сыворотка/плазма крови человека содержит тысячи пептидов, большинство из которых, как считают,
являются фрагментами больших белков, частично разрушенных эндогенными протеолитическими
ферментами [5, 6]. Сложным пептидом, который они создают, однако, можно обеспечить новый и
надежный отпечаток биологических событий во всем организме.

Масс-спектрометрия (MS) – новая технология, обеспечившая быстрый прогресс в области протеомных исследований. С помощью MS можно получить профили экспрессии белков в биологических образцах человека и обнаружить потенциальные биомаркеры рака. Недавние исследования показали эффективность профилирования протеомов в качестве диагностического или прогностического теста для больных РПЖ, используя MS с усиленной поверхностью лазерной десорбцией/ионизацией (SELDIMS) [7]. Технологию SELDI-MS одну из первых применили в качестве профилирования низкомолекулярного протеома (НМП) клинических образцов сыворотки крови для идентификации потенциальных биомаркеров многих видов злокачественных

опухолей человека, включая рак предстательной железы [7–11], толстой кишки [12], мочевого пузыря [13], молочной железы [14], яичников [15, 16] и др. Однако возникли серьезные проблемы с воспроизводимостью технологии SELDI-MS и появилась необходимость в новых масс-спектрометрических стратегиях поиска биомаркеров для раннего обнаружения рака.

Целью данного исследования явились разработка и апробирование новой методологии поиска потенциальных биомаркеров РПЖ. Данный подход включил три основных компонента: предварительное фракционирование образцов плазмы крови магнитными микрочастицами со слабой катионообменной поверхностью [17–21], анализ полученной субфракции низкомолекулярного протеома (НМП) с помощью времяпролетной масс-спектрометрии с активированной матрицей лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF-MS), биоинформационную обработку данных. Продемонстрированы возможности разработанного подхода к обнаружению потенциальных маркеров РПЖ. Выполнен скрининг 46 образцов плазмы крови больных РПЖ и 26 контрольных образцов. В результате проведенного исследования обнаружены пептиды/полипептиды, которые могут в перспективе использоваться в качестве детектирования этого заболевания.

Материалы и методы. Образцы крови больных РПЖ получали из урологического отделения ФГБУ
“РОНЦ им. Н.Н. Блохина” РАМН. В качестве контрольной группы (КГ) использовали образцы от практически здоровых мужчин.

Забор крови проведен в пробирки Vacuta натощак у больных до оперативного вмешательства или
до начала применения противоопухолевой терапии. Кровь центрифугировали в течение 10 мин при 3000 об/мин (1600 g), полученную плазму аликвотировали по 100 мкл и хранили при -80°С. Перед использованием образцы размораживали при комнатной температуре в течение 15 мин и немедленно обрабатывали. Исследовали плазму крови, полученную от 46 больных с гистоло...

В.Е. Шевченко, В.А.Черняев, Н.Е. Арноцкая, В.Б. Матвеев.