Акушерство и Гинекология №11 / 2013
Оценка экспрессии мРНК генов цитокинов в эндометрии при хроническом эндометрите
ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, Москва
Цель исследования. Выявление особенностей экспрессии мРНК генов цитокинов, толл-подобных рецепторов (TLR) и других маркеров иммунокомпетентных клеток в тканях эндометрия при хроническом эндометрите (ХЭ).
Материал и методы. Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени обследованы 110 женщин: 79 пациенток с хроническим эндометритом, 31 условно здоровая пациентка.
Результаты исследования. Описаны особенности экспрессионного профиля цитокинов при хроническом эндометрите, на основе которого предложен способ определения вероятности развития фиброза стромы эндометрия при хроническом эндометрите.
Заключение. Выраженный процесс фиброза стромы эндометрия предложено оценивать по уровню экспрессии мРНК 6 генов: интерлейкинов (IL)1B, IL2, IL10, Foxp3, TLR9 и IL2Ra.
Работа частично поддержана Государственным контрактом Министерства образования и науки РФ № 16.522.12.2009 от 29.09.2011.
Распространенность хронического эндометрита (ХЭ) в общей популяции женского населения по различным оценкам составляет от 0,8 до 19,0% [1]. Заболевание часто приводит к бесплодию, привычному невынашиванию беременности и преждевременным родам [2]. Полагают, что патогномоничным признаком ХЭ являются перименструальные кровянистые выделения из половых путей [3]. Клинико-лабораторная диагностика сложна и основана на результатах ультразвукового исследования, гистероскопии и морфологического исследования [3–6].
Полагают, что существенная роль в развитии ХЭ принадлежит инфекционным поражениям репродуктивных органов, нарушениям местного и общего иммунитета. В ответ на действие различных микроорганизмов, попадающих во влагалище, цервикальный канал и полость матки, в первую очередь включаются механизмы врожденного иммунитета [6, 7]. Инфекционные агенты, связываясь с толл-рецепторами (TLRs), через свои молекулярные паттерны (липополисахариды, пептидогликаны клеточных стенок и др.) активируют клетки макрофагально-моноцитарного ряда, продуцирующие провоспалительные цитокины (интерлейкины (IL) 1, 6, 8, фактор некроза опухоли (TNF)-α, хемокины и интерфероны (IFN) I типа IFNα/β) [8]. Развивается воспаление, направленное на ликвидацию чужеродных агентов, так называемый классический путь активации иммунокомпетентных клеток, который приводит к повышению бактерицидной активности фагоцитирующих клеток. TLR4 взаимодействует с липополисахаридами клеточных стенок грамотрицательных бактерий, TLR9 – с неметилированными CpG-мотивами бактериальной ДНК, TLR2 – с широким спектром паттернов, включая липопротеины и пептидогликаны клеточных стенок грамположительных и грамотрицательных бактерий [9].
Полагают, что система цитокинов представляет собой полиморфную регуляторную сеть медиаторов, которые играют важную роль не только при воспалении слизистой оболочки матки, но и в регуляции физиологических процессов в эндометрии: пролиферации, имплантации, развитии эмбриона, при менструации, родах и др. Цитокины регулируют процессы взаимодействия иммунокомпетентных клеток и могут отражать интенсивность воспалительного процесса при эндометритах.
Цель данного исследования состояла в определении особенностей экспрессии мРНК генов цитокинов, TLRs и других маркеров иммунокомпетентных клеток в тканях эндометрия при ХЭ.
Материал и методы исследования
В исследование были включены 110 женщин репродуктивного возраста от 18 до 45 лет (средний возраст 32,3±5,5 года), обратившиеся в Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова с различными жалобами (таблица). Из них у 79 пациенток в дальнейшем был подтвержден диагноз ХЭ (I группа). Группу сравнения составила 31 условно здоровая пациентка (II группа). Всем пациенткам выполнено ультразвуковое исследование органов малого таза и гистологическое исследование биоптатов эндометрия с окраской гемотоксилином и эозином. Гистероскопия, диагностическое выскабливание слизистой матки проведены 60 пациенткам; аспирационная биопсия эндометрия с помощью кюретки Pipelle de Cornie – 50. Материал для исследования получали на 7–11-й день менструального цикла.
Определение профиля мРНК генов цитокинов (IL-1B, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12A, IL-12B, IL-18, TNFα, трансформирующего фактора роста (TGFβ)-1, IFNG, фактора, ингибирующего лейкемию (LIF), сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGFA) изоформы 121, 165, 189), транскрипционного фактора FoxP3, α-цепи рецептора IL-2 (IL-2RА) и тол-подобных рецепторов (TLR-2, TLR-4, TLR-9) в ткани эндометрия выполнено методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) (ДНК-Технология, Россия).
Во избежание деградации РНК взятие материала (аспират ткани эндометрия) осуществляли в пробирки с раствором гуанидинтиоционата (лизирующий раствор наборы «Проба НК»). Осаждение РНК проводили изопропанолом в присутствии соосадителя, с последующими отмывками промывочными растворами. Производитель гарантировал отсутствие амплификации на матрице геномной ДНК цитокинов и референсных генов. Это позволило не использовать дополнительный этап обработки нуклеиновых кислот ДНК-азой. В реакции обратной транскрипции использовали смесь специфических олигонуклеотидов всех исследуемых генов. Амплификацию осуществляли в режиме реального времени с измерением уровня флуоресценции по каналу FAM на каждом цикле при температуре отжига праймеров. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки. Обработка результатов осуществлялась с помощью програ...
