Оценка качества эмбриона по профилю экспрессии малых некодирующих РНК в культуральной среде эмбриона в программах ВРТ

DOI: https://dx.doi.org/10.18565/aig.2019.6.79-86

01.07.2019
12

ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва

Цель исследования. Изучение профиля малых некодирующих РНК (microRNA и piwiRNA) в культуральной среде эмбриона на 4-е сутки культивирования для идентификации потенциальных биомаркеров качества эмбриона.
Материалы и методы. Применен метод глубокого секвенирования для идентификации спектра малых некодирующих РНК (мнРНК), присутствующих в полости бластоцисты и в культуральной среде эмбриона, количественная оценка которых в 48 образцах культуральной среды эмбрионов, перенесенных в полость матки, была проведена методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией в реальном времени.
Результаты. С помощью дискриминантного анализа методом частных наименьших квадратов (PLS-DA)
был проанализирован вклад шести мнРНК в определение качества эмбриона, характеризуемый значением параметра важности переменной в проекции (variable importance in projection - VIP). В результате анализа было выявлено, что наибольший вклад имеют четыре мнРНК: piR020401 (VIP=1,46027), let-7c-5p (VIP=1,17416), let-7b-5p (VIP=0,994657), let-7i-5p (VIP=0,942665), а наименьший: miR-143-5р (VIP=0,623108) и miR-92a-3p (VIP=0,471951). Методом ранговой корреляции по Спирмену выявлена статистически значимая корреляция между уровнем экспрессии мнРНК (hsa-let-7b-5p, hsa-let-7c-5p, hsa-piR020401) в среде культивирования и качеством переносимого в полость матки эмбриона. Использование непараметрического критерия Манна—Уитни выявило статистически значимые отличия уровня экспрессии piR020401 и miR-92a-3p в среде культивирования эмбрионов, формирующих группы по морфофункциональным параметрам.
Заключение: мнРНК (let-7c-5p, let-7b-5p, piR020401), обнаруженные в культуральной среде, статистически значимо коррелируют с морфофункциональными характеристиками эмбриона на 4 сутки после оплодотворения, среди которых наибольший вклад в определение качества эмбриона вносит piR020401. Уровень экспрессии miR-92a-3p и piR020401 в культуральной среде зависит от стадии развития эмбриона, дифференцируя стадию морулы и бластоцисты. Учитывая, что отставание в скорости развития эмбриона к пятым суткам культивирования не всегда предопределяло отсутствие имплантации эмбриона в матку, ориентироваться исключительно на морфологические параметры эмбриона при выборе кандидата на перенос в полость матки нецелесообразно, а рекомендуется дополнительно оценивать профиль экспрессии let-7c-5p, let-7b-5p, miR-92a-3p, piR020401 на 4 сутки культивирования эмбриона. Таким образом, полученные данные позволяют оптимизировать выбор эмбриона и проведение программы вспомогательных репродуктивных технологий.

Стремительное развитие вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) обусловлено все еще высоким уровнем бесплодия в современном обществе [1]. Несмотря на многие успешные попытки улучшить демографическую ситуацию, доля бесплодных браков на территории России колеблется от 8 до 17,5% и в настоящее время не имеет тенденции к снижению [2]. На сегодняшний день ВРТ занимают ведущее место среди современных методов лечения бесплодия.

Для наступления беременности в программах ВРТ одна из важнейших задач — выбор наиболее качественного и жизнеспособного эмбриона для переноса в полость матки. Селекция таких эмбрионов, как правило, осуществляется на основании оценки их морфологических свойств. Общепринятый стандарт оценки качества бластоцист, предложенный Gardner et al [3], приведен в табл. 1.

Однако критерии качества, предложенные Gardner et al, являются субъективными, а точность такого метода отбора эмбрионов остается недостаточно высокой. Более того, не все эмбрионы «хорошего» и «отличного» качества, с точки зрения морфологических критериев, при переносе в нормальный эндометрий полости матки приводят к беременности [4]. Таким образом, возникает необходимость внедрения дополнительных неинвазивных технологий селективного выбора эмбриона с максимальным имплантационным потенциалом.

За последние годы было изучено значительное число потенциальных биомаркеров качества эмбрионов и их имплантационной способности. Многообещающим методом выступает преимплантационное генетическое тестирование, так как хромосомная патология у переносимых эмбрионов может быть основной причиной неудачных результатов лечения бесплодия. Однако, наряду с бесспорной ценностью, данный метод имеет ограничения для применения в повседневной практике за счет его высокой стоимости, а также необходимости инвазивных вмешательств на эмбрионе [5].

Представление об энергетической, метаболической активности и состоянии сигнальных систем конкретного эмбриона без использования инвазивных методик позволяет получить среда культивирования эмбрионов на различных стадиях развития [6]. Значительным диагностическим и прогностическим потенциалом в отношении качества эмбриона и его имплантационной способности обладают малые некодирующие РНК (мнРНК) при определении уровня их экспрессии в культуральной среде эмбриона [7]. мнРНК действуют на эпигенетическом, транскрипционном и посттранскрипционном уровнях регуляции экспрессии генов. Именно эти взаимодействия определяют различный фенотип и функции клеток организма [8]. Влиянием на фенотип и функцию клеток в большей степени обладают такие мнРНК, как microRNA и piwiRNA [9]. Было доказано, что определение экспрессии данных молекул в культуральной среде эмбриона позволяет прогнозировать его имплантационный потенциал и более точно оценить качество эмбриона [10]. В 2014 г. McCallie et al. [11] впервые выявили, что бластоцисты у пациентов, страдающих бесплодием на фоне СПКЯ, имеют атипичный профиль microRNA (miR-19a, miR-19b, miR-24, miR-92, miR-93 и т.д.), а в 2016 г. Capalbo et al. [12] показали, что внутриклеточная экспрессия microRNA различается у эуплоидных и анеуплоидных эмбрионов. В исследовании Liang et al. [13] было продемонстрировано, что повышенная экспрессия miR-24 в культуральную среду ассоциирована с остановкой бластоцисты в развитии и коррелирует с качеством эмбриона. Таким образом, наличие взаимосвязи между качеством эмбриона и конкретными мнРНК в культуральной среде данных эмбрионов — перспективный и современный метод оптимизации выбора эмбриона при проведении программ ВРТ.

Материалы и методы

49 образцов культуральной среды были собраны на 4-е сутки после оплодотворения от эмбрионов класса А, В и С, согласно морфофункциональной классификации бластоцист, предложенной Gardner et al, а также от эмбрионов на стадии морулы и кавернозной морулы. От эмбрионов класса А было получено 27 образцов культуральной среды, 8 образцов — от эмбрионов класса В, 4 образца — от эмбрионов класса С; оставшиеся 10 образцов соответствовали среде культивирования, полученной от 7 морул и от 3 кавернозных морул. Из собранных образцов были выделены РНК колоночным способом с использованием набора «miRNeasy Serum/Plasma Kit» (Qiagen). Идентификация всех имеющихся мнРНК в среде культивирования эмбриона была осуществлена методом глубокого секвенирования с использованием набора по синтезу кДНК-библиотек NEBNext® Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina® (Set11, New England Biolab®, Germany) на платформе NextSeq 500 platform (Illumina, USA). Относительный уровень экспрессии кДНК оценивали по кратности изменения (КИ) методом ΔΔCt.

M0s1 / M0s2 = 2-∆∆Ct,

где M0s1 и M0s2 – исходные количества кДНК в образцах s1 и s2, ∆∆Сt=(Cts1-Ctnorm1)-(Cts2-Ctnorm2), Ct — значение цикла амплификации в точке пересечения кинетической кривой накопления продукта амплификации с линией порогового уровня флуоресценции, который определяется автоматически программным обеспечением амплификатора StepOnePlus; Cts1 и Cts2 — значение пор...

Список литературы

  1. Сухих Г.Т., Назаренко Т.А., ред. Бесплодный брак. Современные подходы к диагностике и лечению. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2010 518c. .
  2. Корсак В.С., Смирнова А.А., Шурыгина О.В. ВРТ в России. Отчет за 2013 год. Регистр ВРТ. СПб.: Российская Ассоциация Репродукции Человека; 2015: 26-9.
  3. Gardner D.K., Balaban B. Assessment of human embryo development using morpho-logical criteria in an era of time-lapse, algorithms and ‘OMICS’: is looking good still important? Mol. Hum. Reprod. 2016; 22(10): 704-18.
  4. Rocha J.C., Passalia F., Matos F.D., Maserati M.P. Jr., Alves M.F., Almeida T.G. et al. Methods for assessing the quality of mammalian embryos: How far we are from the gold standard? JBRA Assist. Reprod. 2016; 20(3): 150-8.
  5. Кулакова Е.В., Калинина Е.А., Трофимов Д.Ю., Макарова Н.П., Хечумян Л.Р., Дударова А.Х. Вспомогательные репродуктивные технологии у супружеских пар с высоким риском генетических нарушений. Преимплантационный генетический скрининг. Акушерство и гинекология. 2017; 8: 21-7.
  6. Драпкина Ю.С., Тимофеева А.В., Чаговец В.В., Кононихин А.С., Франкевич В.Е., Калинина Е.А. Применение омиксных технологий в решении проблем репродуктивной медицины. Акушерство и гинекология. 2018; 9: 24-32.
  7. Kropp J., Salih S., Khatib H. Expression of microRNAs in bovine and human pre-implantation embryo culture media. Front. Genet. 2014; 5: 91.
  8. Gilchrist G., Tscherner A., Nalpathamkalam T., Merico D., LaMarre J. MicroRNA expression during bovine oocyte maturation and fertilization. Int. J. Mol. Sci. 2016; 17(3): 396.
  9. Houwing S., Kamminga L., Berezikov E., Cronembold D., Girard A., Elst H. et al. A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish. Cell. 2007; 129(1): 69-82.
  10. Rosenbluth E., Shelton D., Sparks A., Devor E., Christenson L., Van Voorhis B. MicroRNA expression in the human blastocyst. Fertil. Steril. 2013; 99(3): 855-61. e3.
  11. Roth L.W., McCallie B., Alvero R., Schoolcraft W.B., Minjarez D., Katz-Jaffe M. Altered microRNA and gene expression in the follicular fluid of women with polycystic ovary syndrome. J. Assist. Reprod. Genet. 2014; 31(3): 355-62.
  12. Capalbo A., Ubaldi F.M., Cimadomo D., Noli L., Khalaf Y., Farcomeni A. et al. MicroRNAs in spent blastocyst culture medium are derived from trophectoderm cells and can be explored for human embryo reproductive competence assessment. Fertil. Steril. 2016; 105(1): 225-35. e1-3.
  13. Liang J., Wang S., Wang Z. Role of microRNAs in embryo implantation. Reprod Biol. Endocrinol. 2017; 15(1): 90.
  14. R Core Team. R: a language and environment for statistical computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria: R Foundation for Statistical Computing; 2018. Available at: https://www.R-project.org/ и программу RStudio
  15. RStudio Team. RStudio: Integrated development for R. RStudio. Boston, MA: RStudio Inc.; 2016. Available at: http://www.rstudio.com/
  16. Wold S., Sjöström M., Eriksson L. PLS-regression: a basic tool of chemometrics. Chemometr. Intell. Lab. Syst. 2001; 58(2): 109-30.
  17. Ruiz-Alonso M., Blesa D., Díaz-Gimeno P., Gómez E., Fernández-Sánchez M., Carranza F. et al. The endometrial receptivity array for diagnosis and personalized embryo transfer as a treatment for patients with repeated implantation failure. Fertil. Steril. 2013; 100(3): 818-24.
  18. Altmäe S., Koel M., Võsa U., Adler P., Suhorutšenko M., Laisk-Podar T. et al. Meta-signature of human endometrial receptivity: a meta-analysis and validation study of transcriptomic biomarkers. Sci. Rep. 2017; 7(1): 10077.
  19. Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Performing the embryo transfer: a guideline. 2013.
  20. Evans J., Hannan N.J., Edgell T.A., Vollenhoven B.J., Lutjen P.J., Osianlis T. et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Hum. Reprod. Update. 2014; 20(6): 808-21.
  21. Roque M., Valle M., Guimarães F., Sampaio M., Geber S. Freeze-all policy: fresh vs. frozen-thawed embryo transfer. Fertil. Steril. 2015; 103(5): 1190-3.
  22. Bashiri A., Halper K.I., Orvieto R. Recurrent implantation failure-update overview on etiology, diagnosis, treatment and future directions. Reprod. Biol. Endocrinol. 2018; 16(1): 121.
  23. Смольникова В.Ю., Калинина Е.А., Краснощока О.Е, Донников А.Е., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т. Возможности неинвазивной оценки состояния ооцита и эмбриона при проведении программ ВРТ по профилю экспрессии мРНК факторов роста в фолликулярной жидкости. Акушерство и гинекология. 2014; 9: 36-43.

Поступила 20.01.2019

Принята в печать 22.02.2019

Об авторах / Для корреспонденции

Тимофеева Анжелика Владимировна, к.б.н., заведующая лабораторией прикладной транскриптомики отдела системной биологии в репродукции
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
Телефон: +7(495) 438-13-41 E-mail: avtimofeeva28@gmail.com
Калинина Елена Анатольевна, д.м.н., доцент, заведующая отделением вспомогательных репродуктивных технологий в лечении бесплодия им. профессора Б.В. Леонова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
Телефон: +7(495) 438-13-41. E-mail: e_kalinina@oparina4.ru
Драпкина Юлия Сергеевна, аспирант отделения вспомогательных репродуктивных технологий в лечении бесплодия им. профессора Б.В. Леонова
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
Телефон: +79169500745 E-mail: julia.drapkina@gmail.com
Чаговец Виталий Викторович, к.ф.-м.н., старший научный сотрудник лаборатории протеомики и метаболомики репродукции человека отдела системной биологии в репродукции ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
Телефон: 8 (926) 562-65-90. E-mail: vvchagovets@gmail.com
Макарова Наталия Петровна. — к.б.н., старший эмбриолог отделения вспомогательных репродуктивных технологий в лечении бесплодия
им. профессора Б.В. Леонова ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: + 7(495) 438-13-41. E-mail: npmakarova@gmail.com
Сухих Геннадий Тихонович - д.м.н., профессор, академик РАН, директор ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: +7(495) 438-18-00 E-mail: gtsukhih@mail.ru

Для цитирования: Тимофеева А.В., Калинина Е.А., Драпкина Ю.С., Чаговец В.В., Макарова Н.П., Сухих Г.Т. Оценка качества эмбриона по профилю экспрессии малых некодирующих РНК в культуральной среде эмбриона в программах вспомогательных репродуктивных технологий. Акушерство и гинекология. 2019;6:79-86.
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2019.6.79-86

Полный текст публикаций доступен только подписчикам

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь