Определение содержания аутоантител к β1-адренорецептору в сыворотке крови пациентов методом конкурентного иммуноферментного анализа на клетках

Цель. Определить содержание аутоантител (аутоАТ) к β1-адренорецептору у больных с желудочковыми нарушениями ритма сердца (ЖНРС) без признаков органического заболевания сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии в сравнении с группой здоровых добровольцев. Материал и методы. В исследование вошли 44 пациента с ЖНРС без признаков органического заболевания сердца («идиопатические»), 34 пациента с диагнозом дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) воспалительного генеза, 35 пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) и ЖНРС, 12 пациентов с ИБС без ЖНРС и 19 здоровых добровольцев (контрольная группа). Содержание аутоАТ к β1-адренорецептору определяли разработанным методом конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) на клетках и при помощи стандартного ИФА с использованием пептидов, соответствующих второй внеклеточной петле β1-адренорецептора. Результаты. Показано повышенное содержание аутоАТ, выявляемых методом конкурентного ИФА на клетках, в группе больных ДКМП: 62% по сравнению с 21% в группе здоровых добровольцев (p=0,0006). В группе пациентов с «идиопатическими» ЖНРС содержание аутоАТ к β1-адренорецептору по сравнению со здоровыми добровольцами в среднем понижено (p=0,003). В группах больных ИБС с ЖНРС и ИБС без ЖНРС отличий от контрольной группы не обнаружено. Количество достоверно положительных сигналов ИФА с пептидами не превысило 10% ни в одной из групп, причем корреляция между результатами конкурентного ИФА на клетках и ИФА с пептидами отсутствует. Выводы. Продемонстрирована принципиальная возможность применения метода конкурентного ИФА на клетках для определения аутоАТ к β1-адренорецептору. Результаты для группы ДКМП в целом соответствуют ожидаемым. Пониженное содержание аутоАТ у пациентов с «идиопатическими» ЖНРС указывает на связь этого заболевания с изменением состояния иммунной системы. В случае ИБС подобная связь не выявлена.

Аутоантитела (аутоАТ) к β1-адренорецептору нередко обнаруживаются у больных с различными формами ишемической болезни сердца (ИБС), в том числе у лиц, перенесших инфаркт миокарда [1, 2], и могут играть важную роль в развитии так называемых идиопатических нарушений ритма у пациентов без органического поражения сердца. Существенный вклад аутоАТ к β1-адренорецептору вносят в развитие дилатационной кардиомиопатии (ДКМП): устойчивая стимуляция β1-адренорецепторов, расположенных на поверхности кардиомиоцитов, циркулирующими в организме аутоАТ-агонистами оказывает кардиотоксическое действие, которое может приводить к хронической сердечной недостаточности и смерти [3, 4]. Согласно некоторым исследованиям, наличие аутоАТ к β1-адренорецептору является независимым предиктором развития опасных для жизни нарушений ритма сердца и внезапной сердечной смерти [4]. Своевременное выявление аутоАТ-агонистов у отдельных категорий больных должно служить обоснованием для применения терапевтической иммунокоррекции (удаление аутоАТ методом плазмафереза, иммуномодулирующая терапия). Несмотря на то что определение аутоАТ к β1-адренорецептору является насущной потребностью клинической практики, соответствующие диагностические наборы в распоряжении клиницистов до сих пор отсутствуют.

Для определения содержания аутоАТ-агонистов к β1-адрено­рецептору используется несколько различных подходов. Наибо­лее адекватными считаются функциональные методы: измерение хронотропного эффекта на культуре кардиомиоцитов [5, 6] или детекция повышения внутриклеточной концентрации cAMP в клетках с рекомбинантным β1-адренорецептором [7]. Распространенность аутоАТ к β1-адренорецептору, определяемая функциональными методами, у больных ДКМП составляет 70—80%, не превышая нескольких процентов у здоровых людей [7, 8]. Оба метода весьма трудоемки, требуют дорогостоящего приборного и программного оснащения и в целом не годятся для использования в повседневной клинической практике.

Поскольку стимулирующим потенциалом в основном обладают аутоАТ ко второй внеклеточной петле β1-адренорецептора [7, 9], то наиболее распространенным до недавнего времени методом определения аутоАТ-агонистов в исследовательских целях был иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием синтетических пептидов, соответствующих последовательности второй внеклеточной петли (аминокислоты 197—222) [4, 10, 11]. Однако в последние годы у ведущих ученых, работающих в данном направлении, сформировалось мнение о неудовлетворительности данных, получаемых методом пептидного ИФА, вследствие их слабой корреляции с результатами функциональных исследований [8, 12]. По-видимому, причина заключается в отличии конформаций синтетических пептидов от природной конформации второй внеклеточной петли и в высокой конформационной чувствительности антител-агонистов [1].

В рамках иммунологических методов анализа альтернативным подходом к решению задачи является использование клеток, экспрессирующих рекомбинантный β1-адренорецептор, в качестве носителя антигена в его природной конформации. Так, B. Bornholz и соавт. [13] разработали технологию цитофлуорометрического анализа, а в работе H.P. Holthoff и соавт. [14] предложен метод конкурентного ИФА на клетках. В методе H.P. Holthoff экспрессия β1-адренорецептора достигается транзитным заражением культуры клеток насекомых бакуловирусом, что значительно затрудняет проведение анализа. Мы модифицировали и упростили технологию H.P. Holthoff и соавт. и разработали на ее основе метод конкурентного ИФА с использованием рекомбинантных моноклональных антител и полученной нами трансгенной линии клеток с экспрессией β1-адренорецептора [15].

Целью настоящего исследования является определение содержания аутоАТ к β1-адренорецептору, выявляемых методом конкурентного ИФА на клетках, в группах больных с желудочковыми нарушениями ритма сердца (ЖНРС) без признаков органического заболевания сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии в сравнении с группой здоровых добровольцев.

Материал и методы

Отбор и обследование пациентов. В исследование были включены 144 человека, в том числе пациенты с ДКМП, с ИБС и нарушениями ритма 2-й градации по Лауну и выше, с ИБС без ЖНРС, с «идиопатическими» ЖНРС и группа здоровых добровольцев, подписавших информированное согласие об участии в исследовании. Всем им было выполнено клинико-инструментальное и лабораторное обследование, включавшее запись 12-канальной электрокардиограммы (ЭКГ), 24-часовое холтеровское мониторирование ЭКГ (ХМ-ЭКГ), эхокардиографию (ЭхоКГ), общий и биохимический анализ крови, исследование показателей клеточного и гуморального иммунного ответа, уровня воспалительных и аутоиммунных маркеров, а также серологических и молекулярно-генетических маркеров инфекции. Для уточнения диагноза по показаниям проводили пробы с дозированной физической нагрузкой, чреспищеводную электростимуля...

Шевелев А.Я., Костюкевич М.В., Ефремов Е.Е, Власик Т.Н., Миронова Н.А., Зыков К.А., Каширина Н.М., Кузнецова И.Б., Шарф Т.В., Мамочкина Е.Н., Липатова Л.Н., Пекло М.М., Руткевич П.Н., Янушевская Е.В., Рыбалкин И.Н., Стукалова  О.В., Малкина Т.А., Беляева М.М., Кузнецова Т.В., Ткачев Г.А., Зинченко Л.В., Гупало Е.М., Агапова О.Ю., Юренева-Тхоржевская  Т.В., Рвачева А.В., Сидорова М.В., Садгян А.С., Терещенко С.Н., Голицын С.П.