Определение содержания аутоантител к β1-адренорецептору в сыворотке крови пациентов методом конкурентного иммуноферментного анализа на клетках

DOI: https://dx.doi.org/10.18565/cardio.2016.11.61-70

02.12.2016
372

1ФГБУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ, Москва; 2ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова Минздрава РФ, Москва

Цель. Определить содержание аутоантител (аутоАТ) к β1-адренорецептору у больных с желудочковыми нарушениями ритма сердца (ЖНРС) без признаков органического заболевания сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии в сравнении с группой здоровых добровольцев. Материал и методы. В исследование вошли 44 пациента с ЖНРС без признаков органического заболевания сердца («идиопатические»), 34 пациента с диагнозом дилатационная кардиомиопатия (ДКМП) воспалительного генеза, 35 пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) и ЖНРС, 12 пациентов с ИБС без ЖНРС и 19 здоровых добровольцев (контрольная группа). Содержание аутоАТ к β1-адренорецептору определяли разработанным методом конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА) на клетках и при помощи стандартного ИФА с использованием пептидов, соответствующих второй внеклеточной петле β1-адренорецептора. Результаты. Показано повышенное содержание аутоАТ, выявляемых методом конкурентного ИФА на клетках, в группе больных ДКМП: 62% по сравнению с 21% в группе здоровых добровольцев (p=0,0006). В группе пациентов с «идиопатическими» ЖНРС содержание аутоАТ к β1-адренорецептору по сравнению со здоровыми добровольцами в среднем понижено (p=0,003). В группах больных ИБС с ЖНРС и ИБС без ЖНРС отличий от контрольной группы не обнаружено. Количество достоверно положительных сигналов ИФА с пептидами не превысило 10% ни в одной из групп, причем корреляция между результатами конкурентного ИФА на клетках и ИФА с пептидами отсутствует. Выводы. Продемонстрирована принципиальная возможность применения метода конкурентного ИФА на клетках для определения аутоАТ к β1-адренорецептору. Результаты для группы ДКМП в целом соответствуют ожидаемым. Пониженное содержание аутоАТ у пациентов с «идиопатическими» ЖНРС указывает на связь этого заболевания с изменением состояния иммунной системы. В случае ИБС подобная связь не выявлена.

Аутоантитела (аутоАТ) к β1-адренорецептору нередко обнаруживаются у больных с различными формами ишемической болезни сердца (ИБС), в том числе у лиц, перенесших инфаркт миокарда [1, 2], и могут играть важную роль в развитии так называемых идиопатических нарушений ритма у пациентов без органического поражения сердца. Существенный вклад аутоАТ к β1-адренорецептору вносят в развитие дилатационной кардиомиопатии (ДКМП): устойчивая стимуляция β1-адренорецепторов, расположенных на поверхности кардиомиоцитов, циркулирующими в организме аутоАТ-агонистами оказывает кардиотоксическое действие, которое может приводить к хронической сердечной недостаточности и смерти [3, 4]. Согласно некоторым исследованиям, наличие аутоАТ к β1-адренорецептору является независимым предиктором развития опасных для жизни нарушений ритма сердца и внезапной сердечной смерти [4]. Своевременное выявление аутоАТ-агонистов у отдельных категорий больных должно служить обоснованием для применения терапевтической иммунокоррекции (удаление аутоАТ методом плазмафереза, иммуномодулирующая терапия). Несмотря на то что определение аутоАТ к β1-адренорецептору является насущной потребностью клинической практики, соответствующие диагностические наборы в распоряжении клиницистов до сих пор отсутствуют.

Для определения содержания аутоАТ-агонистов к β1-адрено­рецептору используется несколько различных подходов. Наибо­лее адекватными считаются функциональные методы: измерение хронотропного эффекта на культуре кардиомиоцитов [5, 6] или детекция повышения внутриклеточной концентрации cAMP в клетках с рекомбинантным β1-адренорецептором [7]. Распространенность аутоАТ к β1-адренорецептору, определяемая функциональными методами, у больных ДКМП составляет 70—80%, не превышая нескольких процентов у здоровых людей [7, 8]. Оба метода весьма трудоемки, требуют дорогостоящего приборного и программного оснащения и в целом не годятся для использования в повседневной клинической практике.

Поскольку стимулирующим потенциалом в основном обладают аутоАТ ко второй внеклеточной петле β1-адренорецептора [7, 9], то наиболее распространенным до недавнего времени методом определения аутоАТ-агонистов в исследовательских целях был иммуноферментный анализ (ИФА) с использованием синтетических пептидов, соответствующих последовательности второй внеклеточной петли (аминокислоты 197—222) [4, 10, 11]. Однако в последние годы у ведущих ученых, работающих в данном направлении, сформировалось мнение о неудовлетворительности данных, получаемых методом пептидного ИФА, вследствие их слабой корреляции с результатами функциональных исследований [8, 12]. По-видимому, причина заключается в отличии конформаций синтетических пептидов от природной конформации второй внеклеточной петли и в высокой конформационной чувствительности антител-агонистов [1].

В рамках иммунологических методов анализа альтернативным подходом к решению задачи является использование клеток, экспрессирующих рекомбинантный β1-адренорецептор, в качестве носителя антигена в его природной конформации. Так, B. Bornholz и соавт. [13] разработали технологию цитофлуорометрического анализа, а в работе H.P. Holthoff и соавт. [14] предложен метод конкурентного ИФА на клетках. В методе H.P. Holthoff экспрессия β1-адренорецептора достигается транзитным заражением культуры клеток насекомых бакуловирусом, что значительно затрудняет проведение анализа. Мы модифицировали и упростили технологию H.P. Holthoff и соавт. и разработали на ее основе метод конкурентного ИФА с использованием рекомбинантных моноклональных антител и полученной нами трансгенной линии клеток с экспрессией β1-адренорецептора [15].

Целью настоящего исследования является определение содержания аутоАТ к β1-адренорецептору, выявляемых методом конкурентного ИФА на клетках, в группах больных с желудочковыми нарушениями ритма сердца (ЖНРС) без признаков органического заболевания сердца и при наличии сердечно-сосудистой патологии в сравнении с группой здоровых добровольцев.

Материал и методы

Отбор и обследование пациентов. В исследование были включены 144 человека, в том числе пациенты с ДКМП, с ИБС и нарушениями ритма 2-й градации по Лауну и выше, с ИБС без ЖНРС, с «идиопатическими» ЖНРС и группа здоровых добровольцев, подписавших информированное согласие об участии в исследовании. Всем им было выполнено клинико-инструментальное и лабораторное обследование, включавшее запись 12-канальной электрокардиограммы (ЭКГ), 24-часовое холтеровское мониторирование ЭКГ (ХМ-ЭКГ), эхокардиографию (ЭхоКГ), общий и биохимический анализ крови, исследование показателей клеточного и гуморального иммунного ответа, уровня воспалительных и аутоиммунных маркеров, а также серологических и молекулярно-генетических маркеров инфекции. Для уточнения диагноза по показаниям проводили пробы с дозированной физической нагрузкой, чрес...

Список литературы

  1. Jahns R., Boivin V., Siegmund C., Inselmann G. et al. Autoantibodies activating human β1-adrenergic receptors are associated with reduced cardiac function in chronic heart failure. Circulation 1999;99:649–654.
  2. Bornholz B., Roggenbuck D., Jahns R., Boege F. Diagnostic and therapeutic aspects of β1-adrenergic receptor autoantibodies in human heart disease. Autoimmun Rev 2014;13:954–962. doi: 10.1016/j.autrev.2014.08.021.
  3. Störk S., Boivin V., Horf R., Hein L. et al. Stimulating autoantibodies directed against the cardiac β1-adrenergic receptor predict increased mortality in idiopathic cardiomyopathy. Am Heart J 2006;152:697–704. doi: 10.1016/j.ahj.2006.05.004.
  4. Iwata M., Yoshikawa T., Baba A. et al. Autoantibodies against the second extracellular loop of β1-adrenergic receptors predict ventricular tachycardia and sudden death in patients with idiopathic dilated cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol 2001;37:418–424.
  5. Magnusson Y., Wallukat G., Waagstein F. et al. Autoimmunity in idiopathic dilated cardiomyopathy characterization of antibodies against the β1-adrenoceptor with positive chronotropic effect. Circulation 1994;89:2760–2767.
  6. Joshi-Barr S., Haberland A., Bartel S. et al. High throughput bioassay for β1-adrenoceptor autoantibody detection. Int J Cardiol 2016;219:98–104. doi: 10.1016/j.ijcard.2016.06.002.
  7. Nikolaev V.O., Boivin V., Störk S. et al. A novel fluorescence method for the rapid detection of functional β1-adrenergic receptor autoantibodies in heart failure. J Am Coll Cardiol 2007;50:423–431. doi: 10.1016/j.jacc.2007.03.051.
  8. Bornholz B., Hanzen B., Reinke Y. et al. Detection of DCM-associated β1-adrenergic receptor autoantibodies requires functional readouts or native human β1-receptors as targets. Int J Cardiol 2016;202:728–730. doi: 10.1016/j.ijcard.2015.10.068.
  9. Wallukat G., Wollenberger A., Morwinski R., Pitschner H.F. Anti-β1-adrenoceptor autoantibodies with chronotropic activity from the serum of patients with dilated cardiomyopathy: mapping of epitopes in the first and second extracellular loops. J Mol Cell Cardiol 1995;27:397–406.
  10. Matsui S., Fu M.L., Shimizu M. et al. Dilated cardiomyopathy defines serum autoantibodies against G-protein coupled cardiovascular receptors. Autoimmunity 1995;21:85–88.
  11. Gupalo E.M., Stukalova O.V., Rogova M.M. et al. Relationship of focal fibrosis according to magnetic resonance tomography, autoantibodies to cardiac membrane receptor and ventricular arrhythmias in patients with dilated cardiomyopathy. Kardiologiia 2014;12:29–36. Russian (Гупало Е.М., Стукалова О.В., Рогова М.М. и др. Взаимосвязь очагового фиброза миокарда по данным магнитно-резонансной томографии, аутоантител к рецепторам кардиомиоцитов и желудочковых нарушений ритма у больных дилатационной кардиомиопатией. Кардиология 2014;12:29–36).
  12. Jahns R., Boege F. Questionable Validity of Peptide-Based ELISA Strategies in the Diagnostics of Cardiopathogenic Autoantibodies That Activate G-Protein-Coupled Receptors. Cardiology 2015;131:149–150. doi: 10.1159/000376546.
  13. Bornholz B., Benninghaus T., Reinke Y. et al. A standardised FACS assay based on native, receptor transfected cells for the clinical diagnosis and monitoring of β1-adrenergic receptor autoantibodies in human heart disease. Clin Chem Lab Med 2016;54:683–691. doi: 10.1515/cclm-2015-0603.
  14. Holthoff H.P., Zeibig S., Jahns-Boivin V. et al. Detection of anti β1-AR autoantibodies in heart failure by a cell-based competition ELISA. Circ Res 2012;111:675–684. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.112.272682.
  15. Shevelev A.Y., Kashirina N.M., Kuznetsova T.B. et al. Cell line expressing recombinant β1-adrenergic receptor for the agonistic autoantibodies detection by a competitive enzyme-linked immunosorbent assay. U.A. Ovchinnikov bulletin of biotechnology and physical and chemical biology 2015;11:5–14. Russian (Шевелев А.Я., Каширина Н.М., Кузнецова И.Б. и др. Линия клеток с экспрессией рекомбинантного β1-адренорецептора для определения уровня аутоантител-агонистов методом конкурентного иммуноферментного анализа. Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова 2015;11:5–14).
  16. Barlos K., Gatos D. Convergent peptide synthesis. In: Chan W.C., White P.D. ed. Fmoc solid phase peptide synthesis. A practical approach. New York: Oxford University Press 2001;215–228.
  17. Bibilashvili R.Sh., Sidorova M.V., Molokoedov A.S. et al. Novel conformational peptide antigen, which simulates an immunodominant epitope of the 2nd extracellular loop of β1-adrenoceptor. Computer simulation, synthesis, spatial structure. Russian Journal of Bioorganic Chemistry 2013;39:658–670. Russian (Бибилашвили Р.Ш., Сидорова М.В., Молокоедов А.С. и др. Новый конформационный пептидный антиген, моделирующий иммунодоминантный эпитоп 2-й внеклеточной петли β1-адренорецептора. Компьютерное моделирование, синтез, изучение пространственной структуры. Биоорганическая химия 2013;39:658–670).
  18. Wallukat G., Schimke I. Agonistic autoantibodies directed against G-protein-coupled receptors and their relationship to cardiovascular diseases. Semin Immunopathol 2014;36:351–363. doi: 10.1007/s00281-014-0425-9.
  19. Christ T., Wettwer E., Dobrev D. et al. Autoantibodies against the beta1 adrenoceptor from patients with dilated cardiomyopathy prolong action potential duration and enhance contractility in isolated cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol 2001;33:1515–1525. doi: 10.1006/jmcc.2001.1414.
  20. Fukuda Y., Miyoshi S., Tanimoto K. et al. Autoimmunity against the second extracellular loop of β1-adrenergic receptors induces early afterdepolarization and decreases in K-channel density in rabbits. J Am Coll Cardiol 2004;43:1090–1100. doi: 10.1016/j.jacc.2003.09.057.
  21. Arndt-Marić R., Nägele H., Schewe G., Kromminga A. Are autoantibodies against the β1-adrenergic receptor markers for dilated cardiomyopathy? Clin Lab 2010;56:519–526.

Об авторах / Для корреспонденции

ФГБУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Минздрава РФ, Москва
Шевелев А.Я. - к.биол.н., вед.н.с. лаборатории клеточной инженерии.
Костюкевич М.В. - аспирант отдела клинической электрофизиологии и рентгенохирургических методов лечения нарушений ритма сердца.
Ефремов Е.Е. - к.биол.н., руков. лаборатории иммунохимии.
Власик Т.Н. - к.биол.н., руков. лаборатории клеточной инженерии.
Миронова. Н.А. - к.м.н., ст.н.с. отдела клинической электрофизиологии и рентгенохирургических методов лечения нарушений ритма сердца.
Зыков К.А. - д.м.н., руков. лаборатории иммунопатологии сердечно-сосудистых заболеваний.
Каширина Н.М. - н.с. лаборатории клеточной инженерии.
Кузнецова И.Б. - мл.н.с. лаборатории иммунохимии.
Шарф Т.В. - н.с. лаборатории иммунохимии.
Мамочкина Е.Н. - н.с. лаборатории иммунохимии.
Липатова Л.Н. - к.биол.н., н.с. лаборатории клеточной инженерии.
Пекло М.М. - к.биол.н., ст.н.с. лаборатории клеточной инженерии.
Руткевич П.Н. - н.с. лаборатории клеточной инженерии.
Янушевская Е.В. - н.с. лаборатории клеточной инженерии.
Рыбалкин И.Н. - н.с. лаборатории клеточной инженерии.
Стукалова О.В. - к.м.н., ст.н.с. отдела томографии.
Малкина Т.А. - к.м.н., н.с. отдела клинической электрофизиологии и рентгенохирургических методов лечения нарушений ритма сердца.
Беляева М.М. - к.м.н., мл.н.с. отдела клинической электрофизиологии и рентгенохирургических методов лечения нарушений ритма сердца.
Кузнецова Т.В. - к.биол.н., ст.н.с. отдела нейрогуморальных и иммунологических исследований.
Ткачев Г.А. - мл.н.с. отдела нейрогуморальных и иммунологических исследований.
Зинченко Л.В. - лаборант-исследователь отдела клинической электрофизиологии и рентгенохирургических методов лечения нарушений ритма сердца.
Гупало Е.М. - к.м.н., мл.н.с. отдела клинической электрофизиологии и рентгенохирургических методов лечения нарушений ритма сердца.
Сидорова М.В. - к.хим.н., руков. лаборатории синтеза пептидов.
Садгян А.С. -
Терещенко С.Н. - д.м.н., проф., директор Института экспериментальной кардиологии, зам. генерального директора по науке, руков. отдела заболеваний миокарда и сердечной недостаточности.
Голицын С.П. - д.м.н., проф., руков. отдела клинической электрофизиологии и рентгенохирургических методов лечения нарушений ритма сердца.
ГБОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова Минздрава РФ, Москва
Агапова О.Ю. - н.с. лаборатории пульмонологии.
Юренева-Тхоржевская Т.В. - к.м.н., ст.н.с. лаборатории пульмонологии.
Рвачева А.В. - к.м.н., ст.н.с. лаборатории пульмонологии.
E-mail: a.shevelev@gmail.com

Полный текст публикаций доступен только подписчикам

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь