Опыт применения импульсного УФ-излучения сплошного спектра плазменных ксеноновых ламп для деконтаминации продуктов ПЦР

Цель исследования. Оценка эффективности разрушения коротких ПЦР-ампликонов с помощью импульсного источника излучения широкого спектра.
Материалы и методы. С помощью источника импульсного УФ-излучения проведены эксперименты на ампликонах ДНК длиной 117 п. н. Эффективность деконтаминации оценивали по остаточному количеству ампликонов в смывах с рабочих поверхностей, таких как пластик, стекло и металл.
Результаты. Была показана высокая эффективность импульсного УФ-излучения в борьбе с контаминацией ДНК, определено оптимальное время облучения (10–12 мин), достаточное для полного разрушения ампликонов на различных типах поверхности (пластик, стекло, металл). Полученные данные позволяют сократить время обработки помещений и снизить негативное воздействие от УФ-излучения на лабораторное оборудование и помещения.
Заключение. Продемонстрирована целесообразность использования импульсных установок, генерирующих высокоинтенсивные потоки УФ-излучения сплошного спектра, для разрушения ампликонов на различных поверхностях.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий определять единичные копии молекул ДНК или РНК в присутствии миллионов других молекул. Открытие метода ПЦР стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Этот метод поднял медицинскую диагностику на качественно новый уровень за счет существенного повышения чувствительности и специфичности в выявлении возбудителей инфекционных заболеваний.

Основные принципы использования праймеров (коротких искусственно синтезированных молекул ДНК) и состав ингредиентов, входящих в реакционную смесь для получения копий ДНК, впервые были описаны K. Kleppe и соавт. в 1971 г. [1]. Однако тогда еще не была продемонстрирована основная характеристика ПЦР – экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК как результат реакции, что было связано с отсутствием термостабильной ДНК-полимеразы.

В 1983 г. сотрудник фирмы «Cetus» K. Mullis предложил метод, который в дальнейшем стал известен как ПЦР [2]. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке строго определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты вновь копируются термостабильной ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что значительно упрощает дальнейший анализ.

Амплификация нуклеиновых кислот почти сразу получила широкое практическое применение. Метод приобрел такую популярность, что сегодня уже трудно представить работу в области молекулярной биологии без его использования. Особенно бурное развитие метод получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные лазерные технологии секвенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Если в недавнем прошлом для расшифровки последовательности ДНК размером в 250 пар нуклеотидов (п.н.) требовалась неделя, то современные лазерные секвенаторы позволяют определять несколько миллионов п.н. за сутки [3]. Это, в свою очередь, способствует значительному росту числа лабораторий, применяющих в своих целях различные модификации ПЦР, от создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов до выявления точечных (однонуклеотидных) мутаций в исследуемом гене. На сегодняшний день описаны десятки различных вариантов применения ПЦР в качестве основного метода диагностики инфекционных заболеваний, позволяющего определять непосредственно возбудителя заболевания в очень низкой концентрации [4–6], на уровне единичных копий ДНК патогена.

Высокая чувствительность ПЦР делает совершенно необходимым наличие нескольких изолированных друг от друга помещений в ПЦР-лаборатории и выдвигает на первый план проблему контаминации, т. е. попадания из внешней среды в реакционную смесь специфических и неспецифических молекул ДНК, способных служить мишенями в реакции амплификации и давать ложноположительные или ложноотрицательные результаты. Такими мишенями могут быть продукты реакции, попадающие во внешнюю среду на этапе детекции из пробирок, в которых успешно прошла амплификация, либо специфическая ДНК из образцов на этапе пробоподготовки [7].

Существует несколько способов борьбы с этим неприятным явлением. Одним из них является фотохимическое воздействие на молекулы ДНК. Для этого используют псорален или изопсорален, которые активируются кратковременным облучением ультрафиолетовым (УФ) светом и реагируют с молекулами ДНК и РНК. Модифицированные таким способом молекулы нуклеиновых кислот не могут участвовать в реакции амплификации [8].

Однако, как известно, ни одна биологическая или химическая реакция не идет со 100% эффективностью и, соответственно, после инактивации про...

Тутельян А.В., Черкаши Е.А., Замотаева Т.Л., Абросимова О.А., Потапенко А.О., Шашковский С.Г., Гольдштейн Я.А., Акимкин В.Г.