Особенности полиморфизма генов MMP1, ММP3, PAI1 у больных с пролапсом тазовых органов и стрессовым недержанием мочи

15.09.2014
1319

ФГБУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН, Санкт-Петербург, Россия

Цель исследования. Оценка связи между полиморфизмом генов MMP1(rs1799750), MMP3, (rs3025058), гена PAI (rs1799768) и риском возникновения пролапса тазовых органов (ПТО) и стрессового недержания мочи (СНМ).
Материал и методы. Исследуемые группы состояли из пациенток с ПТО 1–4-й стадии по POP -Q шкале (n=63) и пациенток с ПТО и СНМ (n=65). Женщины без ПТО и без жалоб на недержание мочи были включены в контрольную группу (n=117). Образцы ДНК были выделены из цельной крови. Тип полиморфизма был определен методом ПЦР – ПДРФ.
Результаты. Выявлены статистически значимые различия в распределении частот полиморфизмов MMP1 (rs1799750), MMP3(rs3025058), PAI (rs1799768) у женщин исследуемых групп и контрольной группы. Генотип 1G/1G по гену ММР-1 повышает вероятность ПТО в 2,1 раза (OR=2,1 95% CI: 1,05-4,38), генотип 5G/5G по гену MMP3 – развитие ПТО в 3,4 раза (OR=3,38 95% CI: 1,64-6,99), а ПТО+СНМ – в 3,3 раза (OR=3,29 CI: 1,43-7,57). Генотип 5G/5G PAI повышает вероятность развития ПТО в 3,2 раза (OR=3,16 95% CI: 1,6-6,2), сочетания ПТО и СНМ в 5,3 раза (OR=5,3 95% CI: 2,7-10,7).
Заключение. Полиморфизм генов MMP1 (rs1799750), MMP3(rs3025058), PAI(rs1799768) играет роль в этиологии и патогенезе ПТО и СНМ.

Проблемы недержания мочи у женщин с пролапсом тазовых органов (ПТО) заставляют их прибегать к оперативному лечению, так как приводят к серьезной социальной дезадаптации, снижают трудоспособность, сексуальную активность, влияют на качество жизни.

Эндогенные патогенетические механизмы декомпенсации эластических свойств тканей тазового дна при ПТО и стрессовом недержании мочи (СНМ) остаются недостаточно изученными. Известно, что подверженность человека различным заболеваниям может определяться так называемыми «генами предрасположенности» [1]. Некоторые данные современных исследований позволяют связывать полиморфизм генов, определяющих синтез коллагена, ферментов деградации коллагена, в частности семейства металлопротеиназ (ММР-1, MMP-2, MMP-9) с риском развития ПТО и СНМ [2–5]. Также известно, что активация прометаллопротеиназ таких, как про-ММР-1,-3-9,-10,-13, непосредственно осуществляется ферментом плазмином, тогда как ингибитор активатора плазминогена (PAI 1) препятствует превращению плазминогена в плазмин и, следовательно, нарушает активацию ММР, замедляя, таким образом, деградацию соединительной ткани [6]. Поиск и исследование генов – кандидатов ПТО и СНМ является важным аспектом изучения патогенеза заболевания, открывает новые возможности для выявления женщин групп риска по развитию данной патологии, прогнозирования клинического течения заболевания, а также для выбора методов профилактики и оперативного лечения.

Цель исследования: выяснить особенности полиморфизма генов MMP1 (матриксная металлопротеиназа-1), MMP3 (матриксная металлопротеиназа-3), PAI (ингибитор активатора плазминогена) у больных с ПТО и СНМ.

Материал и методы исследования

Обследованы 128 пациенток: 63 женщины с ПТО и 65 женщин с ПТО и СНМ, жителей Северо-Западного региона России, представителей европеоидной расы. От каждой женщины в установленном порядке получено информированное согласие на проведение данного исследования. Средний возраст пациенток в указанных группах составил 65,3±5,4 и 66,5±6,7 года соответственно. Результаты объективного обследования состояния тазового дна пациенток представлены на рисунке.

Группа сравнения (n=117) представляла собой популяционную выборку женщин, не имеющих на момент исследования клинических признаков ПТО и недержания мочи и проживающих в Северо-Западном регионе России.

Образцы ДНК, полученные стандартным методом из лимфоцитов периферической крови, были использованы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) и ПЦР-ПДРФ – анализа (анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов) генов MMP1, ММP3, PAI1. Cмесь для ампли­фикации обьемом 25 мкл включала 15 нМ каждого праймера, 67 мМ трис-HCl, рН 8.8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мМ MgCl2, 6,7 мкМ ЭДТА, 10 мМ меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 мМ каждого dNTP и 1U Taq-ДНК-полимеразы. Для проведения ПЦР использовали следующие олигонуклеотидные праймеры:

MMP1 (1G/2G)- F TGACTTTTAAAACATAGTCTATGTTCA
R TCTTGGATTGATTTGAGATAAGTCATAGC
MMP3 (5A/6A)- F TTCTCCATTCCTTTGATGGGGGGAAAGA
R TTCCTGGAATTCACATCACTGCCACCACT
PAI (4G/5G) – F CACAGAGAGA GTCTGGCCACTT
R GGCCCAACAGAGGACTCTTG

Для амплификации использовали программируемый термоциклер «ДНК-технология» (Москва). Для проведения ПЦР использовали следующие условия: после денатурации (94оС, 7 мин) проводили 30 циклов амплификации в режиме: для ММР1, ММР3 – 94оС-40сек; 56оС-40сек; 72оС-1 мин, для PAI – 94оС-50сек; 56оС-50сек; 72оС-1 мин с заключительным синтезом 5 мин при 72оС. Для идентификации аллелей полиморфного сайта (rs1799750) гена ММР1 (-1607del G, (G>GG)) продукты амплификации расщепляли эндонуклеазой Alu1 (1G аллель содержит уникальный сайт для Alu1). Для идентификации аллелей полиморфного сайта (rs3025058) гена ММР3 (-1171, 5A/6A) продукты амплификации расщепляли эндонуклеазой Tth111I (5A аллель содержит уникальный сайт для Tth111I). Для идентификации аллелей полиморфного сайта (rs1799768) гена PAI (-675 5G/4G) продукты амплификации расщепляли эндонуклеазой Tth111I (5G аллель содержит уникальный сайт для Tth111I). После окончания ПЦР полноту гидролиза оценивали по результатам электрофореза в 7,5% полиакриламидном геле после окраски этидиумбромидом и визуализации в ультрафиолетовом свете.

Статистическая обработка данных проводилась методами описательной статистики и сравнения выборок, с использованием t-критерия Стюдента, критерия χ2 с поправкой Йетса, коэффициента соотношения шансов (OR). Уровень статистической значимости (р) принят ≤0,05. Обработка данных проводилась с использованием программы «Instat».

Результаты исследования

Распределение частот генотипов по гену MMP1(rs1799750) у пациентов с ПТО и СНМ в основных группах и группе контроля представлены в табл. 1. Достоверных различий частот аллелей 1G и 2G в основных группах и в группе сравнения не выявлено. Вместе с тем, гомозиготы по аллелю 1G (1G/1G) гена ММР1 в группе ПТО встречалось достоверно чаще, чем в группе сравнения (р=0,03). При сравнении всех групп достоверных различий в частотах других генотипов по гену ММР1 выявлено не было. Согласно рассчитанному коэффициенту соотношения шансов, наличие генотипа 1G/1G по гену ММР1 повышает вероятность развития ПТО в 2,1 раза (OR=2,1 95%CI: 1,05-4,38).

Как следует из данных, приведенных в табл. 2, распределение частот генотипов и аллелей по изученному полиморфизму гена MMP3 между группами исследованных пациентов и контрольной выборки имеет достоверные различия. В частности, выявлено достоверное преобладание частоты аллели 5A в группах пациентов по сравнению с контрольной группой. В группе ПТО в сочетании с СНМ выявлено достоверное преобладание генотипа 5A/5A по сравнению с таковым в контрольной группе (р=0,01) и в группе ПТО без СНМ (р=0,001). Согласно рассчитанному коэффициенту соотношения шансов, наличие 5A/5A MMP3 генотипа повышает вероятность ПТО приблизительно в 3,4 раза (OR=3,38 95% CI: 1,64-6,99), вероятность сочетанной патологии (ПТО + СНМ) приблизительно в 3,3 раза (OR=3,29 95% CI: 1,43-7,57).

Как следует из представленных в табл. 3 данных, между группами с ПТО и группой сравнения имеются достоверные различия в распределении генотипов и аллелей полиморфизма rs1799768 по гену PAI. В группах обследованных пациентов выявлено достоверное преобладание 5G/5G генотипа, по сравнению с контролем. Согласно рассчитанному коэффициенту соотношения шансов, наличие 5G/5G генотипа по гену PAI повышает вероятность ПТО в 3,2 раза (OR=3,16 95% CI: 1,6-6,2), а 5G/5G генотипа – вероятность ПТО + СНМ в 5,3 раза (OR=5,3 95% CI: 2,7-10,7).

Обсуждение

Гистологические и иммуногистохимические исследования тканей пациенток с ПТО и СНМ описывают патологические изменения соединительнотканных и мышечных компонентов тазового дна, обусловливающие их функциональную несостоятельность [7–9]. Согласно современным представлениям указанные изменения являются формой проявления дисплазии соединительной ткани (ДСТ) [7, 10]. ДСТ – полиорганная или полисистемная патология с прогредиентным течением, в основе которой лежат дефекты синтеза или катаболизма компонентов внеклеточного матрикса или регуляторов морфогенеза соединительной ткани [11]. Матриксные металлопротеиназы (ММР) — протеолитические ферменты (эндопептидазы), участвующие в деструкции и ремоделировании соединительной ткани [12]. МMP принадлежит важная роль регуляторов в поддержании гомеостаза экстрацеллюлярного матрикса при физиологических состояниях (заживление ран) и при патологических процессах (воспаление, ревматоидный артрит, метастазирование, разрушение хряща, формирование аневризмы миокарда и др.) [13, 14]. Существуют иммуногистохимические данные, указывающие на важную роль дисбаланса ММР, а также тканевых ингибиторов ММР в развитии патологии тазового дна (СНМ и ПТО) [9]. В последнее время появляются сообщения об ассоциации генетически-детерминированной активности ферментов семейства ММР, в частности ММР1, с патогенезом ПТО и недержанием мочи при напряжении [15, 16]. ММР1 — коллагеназа-1, синтезируемая фибробластами соединительной ткани и моноцитами. ММР1 является одним из ферментов, осуществляющих первый этап катаболизма интерстициального коллагена I, II и III типов [12]. Стоит отметить, что коллагеновые волокна в структурах поддерживающего аппарата органов малого таза в основном образованы коллагеном I и III типов [9]. Полиморфизм в гене ММР1 – инсерция гуанина (G) в положении 1607 – определяет наличие двух аллелей гена: 1G (содержащий в своем составе один остаток гуанин в положении 1607) и 2G (содержащий последовательность из 2 остатков гуанина). Результатом мутации в гене ММР1 является повышенное образование соответствующего фермента. Предполагается, что отмеченная при иммуногистохимических исследованиях высокая экспрессия ММР1 в биоптатах тканей пациенток с ПТО обусловлена мутацией в гене соответствующего фермента. Так S. Vishwajit и соавт. отмечали у пациенток с ПТО и СНМ достоверное преобладание в сравнении с популяционными данными частоты мутантного аллеля 2G, ассоциированного с повышенной активностью фермента ММР1 [16]. В нашем исследовании достоверной разницы частот аллелей 1G, 2G гена ММР1 в исследуемых группах и в популяционной выборке выявлено не было. Однако в группе ПТО генотип 1G/1G встречался достоверно чаще, чем в контрольной выборке, что согласуется с данными Ю.А. Дегтяревой [17]. В группе ПТО и СНМ не выявлено достоверных различий частот изучаемых генотипов по сравнению с контролем. Таким образом, отмеченная при иммуногистохимических исследованиях высокая активность ММР1 в тканях больных с ПТО [18] может быть обусловлена не только аллельными вариантами соответствующего гена, но связана с нарушением регуляции его активности в тканях в результате действия тканевого ингибитора ММР1. Противоречивость полученных данных свидетельствует о необходимости дальнейших исследований по уточнению роли полиморфизма гена ММР1 и факторов регуляции его активности на тканевом уровне в патогенезе ПТО и СНМ. MMP3, также называемая стромелизином-1, катализирует деградацию многих компонентов соединительной ткани, включая протеогликаны, линк-белок, коллаген типов II, IV, IX и XI, ламинин и фибронектин. MMP3 может также влиять на деградацию экстрацеллюлярного матрикса через активацию проколлагеназы-1. Известно, что MMP3 играет важную роль в естественных процессах тканевого ремоделирования и патологических процессах (остеоартритах и ревматоидных артритах). Полиморфный вариант гена MMP3 (-1171 5А>6А) представляет собой инсерционно-делеционный полиморфизм, который изменяет сайт связывания транскрипционного фактора NFκB, что влияет на экспрессию гена ММР3. Аллель 5A повышает экспрессию данного гена, тогда как 6А аллель ассоциирован с более низкой активностью промотора и соответственно низкой экспрессией гена [12]. В нашем исследовании обнаружено достоверное преобладание 5G/5G генотипа MMP3 в группах больных с ПТО без СНМ, а также в сочетании с СНМ по сравнению с контрольной группой. Эти результаты позволяет полагать, что генотип 5G/5G гена ММР3 играет роль в развитии ПТО и СНМ.

Белок PAI относится к семейству «серпинов». Его основная функция заключается в быстрой инактивации тканевого активатора плазминогена [6]. Хорошо изученным к настоящему времени является 4G/5G полиморфизм в – 675 положении от стартовой точки промотора гена PAI1. В результате делеции/инсерции образует повтор из 4 или 5 оснований гуанина и соответственно, 3 варианта аллелей – 5G/5G, 5G/4G и 4G/4G. В опытах на культуре клеток было показано, что 4G аллель может связываться только с энхансером, что увеличивает синтез PAI. В то же время 5G аллель связывается как с энхансером, так и супрессором, что обусловливает снижение скорости транскрипции при 5G/5G генотипе и соответственно более низкий уровень активности PAI1 [19]. Мы установили, что существует достоверное преобладание генотипа 5G/5G PAI у больных обследованных групп с ПТО и СНМ по сравнению с контрольной группой. Известно, что плазмин непосредственно активирует про-ММР-1, -3–9, -10, -13. PAI препятствует превращению плазминогена в плазмин и, следовательно, противодействует данному пути активации ММР, замедляя деградацию соединительной ткани. Соответственно при 5G/5G генотипе и более низкой функциональной активности PAI происходит повышенное образование плазмина и активация металлопротеиназ, что способствует деградации соединительной ткани у больных с ПТО и СНМ

Заключение

Данные анализа полиморфизма изученных генов подтверждают гипотезу о роли наследственной ДСТ в этиологии и патогенезе ПТО и СНМ. Одним из эндогенных факторов, способствующих развитию данной патологии является мутация генов ММР1, MMP3 и PAI. Необходимы дальнейшие углубленные исследования для решения вопроса о том в какой мере тестирование полиморфизмов генов ММР1 MMP3 и PAI может быть применено для отбора женщин групп повышенного риска по развитию данных заболеваний.

Список литературы

1. Баранов В.С. Генетический паспорт – основа индивидуальной и предиктивной медицины. СПб.: Н–Л; 2009.
2. Апокина А.Н. Прогнозирование эффективности хирургической коррекции пролапса тазовых органов: Дис. … канд. мед. наук. М.; 2012.
3. Campeau L., Gorbachinsky I., Badlani G.H., Andersson K.E. Pelvic floor disorders: linking genetic risk factors to biochemical changes. Br. J. Urol. Int. 2011; 108(8): 1240-7.
4. Chen H.Y., Lin W.Y., Chen Y.H., Chen W.C., Tsai F.J., Tsai C.H. Matrix metalloproteinase-9 polymorphism and risk of pelvic organ prolapse in Taiwanese women. Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod Biol. 2010; 14: 222-4.
5. Kluivers K.B., Dijkstra J.R., Hendriks J.C., Lince S.L., Vierhout M.E., van Kempen L.C. COL3A1 2209G>A is a predictor of pelvic organ prolapse. Int. Urogynecol. J. Pelvic Floor Dysfunct. 2009; 20(9): 1113-8.
6. Thögersen A.M., Jansson J.H., Boman K., Nilsson T.K., Weinehall L., Huhtasaari F. et al. High plasminogen activator inhibitor and tissue plasminogen activator levels in plasma precede a first acute myocardial infarction in both men and women: evidence for the fibrinolytic system as an independent primary risk factor. Circulation. 1998; 98(21): 2241-7.
7. Смольнова Т.Ю. Клинико-патогенетические аспекты опущения и выпадения внутренних половых органов и патологии структур тазового комплекса у женщин при дисплазии соединительной ткани. Тактика ведения: Дис. … д-ра мед. наук. М.; 2009.
8. Lin S.Y., Tee Y.T., Ng S.C., Chang H., Lin P., Chen G.D. Changes in the extracellular matrix in the anterior vagina of women with or without prolapse. Int. Urogynecol. J. Pelvic Floor Dysfunct. 2007; 18(1): 43-8.
9. Moalli P.A., Shand S.H., Zyczynski H.M., Gordy S.C., Meyn L.A. Remodeling of vaginal connective tissue in patients with prolapse. Obstet. Gynecol. 2005; 106(5, Pt 1): 953-63.
10. Адамян Л.В., Смольнова Т.Ю., Банин В.В. Роль «тканевого фенотипа» в развитии гинекологических заболеваний. Проблемы репродукции. 2007; 4: 6-11.
11. Кадурина Т.И., Горбунова В.Н. Дисплазия соединительной ткани. Руководство для врачей. СПб.: ЭЛБИ; 2009.
12. Visse R., Nagase H. Matrix мetalloproteinases and тissue inhibitors of metalloproteinases: structure, function, and biochemistry. Circ. Res. 2003; 92: 827-39.
13. Dörr S., Lechtenböhmer N., Rau R., Herborn G., Wagner U., Müller-Myhsok B. et al. Association of a specific haplotype across the genes MMP1 and MMP3 with radiographic joint destruction in rheumatoid arthritis. Arthritis Res. Ther. 2004; 6(3): 199-207.
14. Liu P.Y., Li Y.H., Tsai W.C., Tsai L.M., Chao T.H., Wu H.L. et al. Stromelysin-1 promoter 5A/6A polymorphism is an independent genetic prognostic risk factor and interacts with smoking cessation after index premature myocardial infarction. J. Thromb. Haemost. 2005; 3(9): 1998-2005.
15. Vishwajit S., Fuelhase C., Badlani G. The biochemistry of wound healing in the pelvic floor: what have we learned? Curr. Bladder Dysfunct. Rep. 2009; 4: 13-9.
16. Vishwajit S., Rohozinski J., Badlani G., Andersson K. Association of MMP-1 promoter variant with stress urinary incontinence and pelvic organ prolapse in women. J. Urol. 2009; 181(4, Suppl.): 481. Available at: http://www.icsoffice.org/ASPNET_Membership/Membership/Abstracts/Publish/47/000294.pdf (дата обращения 16.03.14)
17. Дегтярева Ю.А. Пролапс тазовых органов у женщин: факторы риска, прогнозирование клинического течения заболевания: Дис. … канд. мед. наук. СПб.; 2010.
18. Chen B.H., Wen Y., Li H. Collagen metabolism and turnover in women with stress urinary incontinence and pelvic prolapse. Int. Urogynecol. J. 2002; 13: 80-7.
19. Sykes T.C., Fegan C., Mosquera D. Thrombophilia, polymorphisms, and vascular disease. Mol. Pathol. 2000; 53(6): 300-6.

Об авторах / Для корреспонденции

Русина Елена Ивановна, к.м.н., с.н.с. отделения оперативной гинекологии ФБГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН. Адрес: 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. E-mail: pismo_rusina@mail.ru
Беженарь Виталий Федорович, д.м.н., профессор, руководитель отделения оперативной гинекологии ФБГУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН. Адрес: 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. Телефон: 8 (812) 328-23-61. E-mail: bez-vitaly@yandex.ru
Иващенко Татьяна Эдуардовна, д.б.н, профессор, лаборатория пренатальной диагностики врожденных и наследственных болезней ФГБУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН. Адрес: 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. Телефон: 8 (812) 328-23-61. E-mail: tivashchenko2011@mail.ru
Пакин Владимир Степанович, клинический ординатор, лаборатория пренатальной диагностики врожденных и наследственных болезней ФГБУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН. Адрес: 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. Телефон: 8 (812) 328-23-61. E-mail: pakins@list.ru
Баранов Владислав Сергеевич, член-корр. РАМН, д.м.н., проф. руководитель лаборатории пренатальной диагностики врожденных и наследственных болезней ФГБУ НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта СЗО РАМН. Адрес: 199034, Россия, Санкт-Петербург, Менделеевская линия, д. 3. Телефон: 8 (812) 328-23-61. E-mail: baranov@VB2475.spb.edu

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь