Особенности профиля секретируемых белков клетками из эндометриоидных очагов и эутопического эндометрия женщин с наружным генитальным эндометриозом в культуре in vitro

DOI: https://dx.doi.org/10.18565/aig.2019.8.90-99

01.09.2019
10

1) ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия; 2) ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова (Сеченовский университет)» Минздрава России, Москва, Россия; 3) ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет  им. Н.И. Пирогова» Минздрава России, Москва, Россия

Цель. Провести сравнительную оценку профиля секретируемых в культуре in vitro белков клетками из эндометриоидных очагов и эутопического эндометрия женщин с наружным генитальным эндометриозом.
Материал и методы. Клетки, выделенные из образцов эндометриоидных гетеротопий и эутопического эндометрия 21 женщины с наружным генитальным эндометриозом, и клетки эндометрия 8 женщин без эндометриоза культивировали in vitro. Поверхностный фенотип клеток, взятых после первого пассажа, определяли с помощью проточного цитофлуориметра и стандартного набора моноклональных антител. В кондиционированной среде культур во время 2-го пассажа определяли концентрацию различных растворимых аналитов с использованием мультиплексного анализа.
Результаты. Клетки из эндометриоидных очагов и эутопического эндометрия, культивированные до 2 пассажа, прилипали к пластику, имели фибробластоподобную морфологию, фенотипически соответствовали минимальным критериям, принятым для идентификации мезенхимальных стромальных клеток. В супернатантах культур выявлен различный уровень продукции исследованных белков клетками из очагов эндометриоза и эутопического эндометрия.
Заключение. Продукция in vitro широкого спектра белков, характеризующих функциональное состояние стромальных клеток, выделенных из эктопических очагов эндометриоза, указывает на состояние повышенной активации клеток в эндометриоидных очагах, что является важным патогенетическим фактором развития эндометриоза.

Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) — распространенное гинекологическое заболевание, при котором клетки эндометрия (внутреннего слоя стенки матки) разрастаются за пределами матки. Участие иммунной системы в патогенезе эндометриоза считается установленным [1–4]. К иммунным нарушениям при эндометриозе относят снижение реакций клеточной цитотоксичности в отношении клеток аутологичного эндометрия и развитие аутоиммунных реакций [5–8]. Для эндометриоза характерно развитие локального воспаления с системной субклинической манифестацией [9–12].

Для более полного понимания патогенеза НГЭ представляется важным изучение роли ангиогенных, нейрогенных, лимфоангиогенных факторов, цитокинов, хемокинов, различных ростовых факторов в формировании и прогрессировании очагов НГЭ. Исследование механизмов патогенеза и поиск диагностических маркеров НГЭ необходимы для разработки ранней неинвазивной диагностики и патогенетической терапии данного заболевания.

Самым распространенным материалом для изуче­ния патогенеза развития НГЭ является перитонеаль­ная жидкость, которую используют для изучения фенотипа и функционального состояния перитонеальных макрофагов, содержания цитокинов, хемокинов, различных ростовых факторов [13–17]. Однако получение перитонеальной жидкости возможно только при инвазивных вмешательствах, что значительно ограничивает возможности исследования.

Поэтому изучение патогенеза эндометриоза часто проводится с использованием экспериментальных моделей, в частности in vitro. В настоящее время уже создана иммортализованная линия эндометриоидных клеток человека KC02-44D, цитоскелет, экспрессия генов и биохимический фенотип которых сходны с таковыми у зародышевых эндометриальных стромальных клеток. Как предполагается, эта линия клеток может быть полезной в изучении эндометриальной функции и ассоциированных с ней патологий [18]. Описаны процедуры создания и поддержания первичных культур клеток поверхностного эпителия яичников, трубного эпителия и эндометрия человека, протоколы для иммортализации, клональной изоляции и сокультивирования со стромальными клетками, что может быть полезно для исследования молекулярной и клеточной функции этих видов эпителия в норме и при патологии [19].

Перспективным направлением представляется сравнительное исследование фенотипа и функциональной активности при культивировании in vitro клеток из эутопического эндометрия и очагов эндометриоза различной локализации [20, 21]. Целью настоящей работы являлась сравнительная оценка профиля секретируемых белков клетками из эндометриоидных очагов и эутопического эндометрия женщин с НГЭ в культуре in vitro.

Материал и методы

Образцы эутопического и эктопического эндометрия забирали во время малоинвазивных операций – лапароскопии в сочетании с гистероскопией у 21 пациентки с НГЭ, которые проходили стационарное лечение в отделении оперативной гинекологии и в хирургическом отделении ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (РФ). Всем женщинам диагноз НГЭ был поставлен интраоперационно и подтвержден гистологически. У 18 пациенток были взяты парные образцы эутопического эндометрия и эндометриоидных гетеротопий. Контрольные образцы эндометрия были взяты у 8 пациенток, прооперированных по поводу миомы матки (n=3), неполной и полной внутриматочной перегородки (n=4), кисты яичника (n=1). Отсутствие эндометриоза у этих пациенток было подтверждено во время оперативного вмешательства по поводу основного заболевания.

Возраст пациенток, включенных в исследование, варьировал от 25 до 40 лет. От каждой пациентки было получено информированное согласие на проведение данного исследования.

Образцы эутопического эндометрия и очагов эндометриоза помещали в стерильные пробирки и немедленно транспортировали в лабораторию. Образцы тканей промывали раствором фосфатно-солевого буфера, механически измельчали и затем инкубировали в 0,07% растворе коллагеназы IА (Sigma-Aldrich, США) при 37 °С в течение 30 минут. Смесь центрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 минут, надосадочную жидкость удаляли и осадок ресуспендировали в среде DMEM/F-12 («ПанЭко», РФ), содержавшей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Великобритания), 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина («ПанЭко», РФ).

Полученную клеточную суспензию переносили в культуральные флаконы площадью 25 см2, плотность посева составляла 35×103 ядросодержащих клеток на 1 см2.

Поверхностный фенотип клеток, взятых после первого пассажа, определяли с помощью стандарт...

Список литературы

  1. Ahn S.H., Monsanto S.P., Miller C., Singh S.S., Thomas R., Tayade C. Pathophysiology and Immune Dysfunction in Endometriosis. Biomed. Res. Int. 2015; 2015: 795976.
  2. Miller J.E., Ahn S.H., Monsanto S.P., Khalaj K., Koti M., Tayade C. Implications of immune dysfunction on endometriosis associated infertility. Oncotarget. 2017; 8(4): 7138-47.
  3. Kobayashi H., Higashiura Y., Shigetomi H., Kajihara H. Pathogenesis of endometriosis: the role of initial infection and subsequent sterile inflammation (Review). Mol. Med. Rep. 2014; 9(1): 9-15.
  4. Králíčková M., Vetvicka V. Immunological aspects of endometriosis: a review. Ann. Transl. Med. 2015; 3(11): 153.
  5. Jeung I., Cheon K., Kim M.R. Decreased cytotoxicity of peripheral and peritoneal natural killer cell in endometriosis. Biomed. Res. Int. 2016; 2016:2916070.
  6. Caserta D., Mallozzi M., Pulcinelli F.M., Mossa B., Moscarini M. Endometriosis allergic or autoimmune disease: pathogenetic aspects--a case control study. Clin. Exp. Obstet. Gynecol. 2016; 43(3): 354-7.
  7. Thiruchelvam U., Wingfield M., O’Farrelly C. Natural killer cells: key players in endometriosis. Am. J. Reprod. Immunol. 2015; 74(4): 291-301.
  8. Eisenberg V.H., Zolti M., Soriano D. Is there an association between autoimmunity and endometriosis? Autoimmun. Rev. 2012; 11(11): 806-14.
  9. Agic A., Xu H., Finas D., Banz C., Diedrich K., Hornung D. Is endometriosis associated with systemic subclinical inflammation? Gynecol. Obstet. Invest. 2006; 62(3): 139-47.
  10. Sapkota Y., Low S.K., Attia J., Gordon S.D., Henders A.K., Holliday E.G. et al. Association between endometriosis and the interleukin 1A (IL1A) locus. Hum. Reprod. 2015; 30(1): 239-48.
  11. Sheveleva T., Bejenar V., Komlichenko E., Dedul A., Malushko A. Innovative approach in assessing the role of neurogenesis, angiogenesis, and lymphangiogenesis in the pathogenesis of external genital endometriosis. Gynecol. Endocrinol. 2016; 32(Suppl. 2): 75-9.
  12. Jiang L., Yan Y., Liu Z., Wang Y. Inflammation and endometriosis. Front. Biosci. (Landmark Ed). 2016; 21: 941-8.
  13. Barcz E., Milewski Ł., Dziunycz P., Kamiński P., Płoski R., Malejczyk J. Peritoneal cytokines and adhesion formation in endometriosis: an inverse association with vascular endothelial growth factor concentration. Fertil. Steril. 2012; 97(6): 1380-6.
  14. Соколов Д.И., Кондратьева П.Г., Ярмолинская М.И., Крамарева Н.Л., Селютин А.В., Рулев В.В., Ниаури Д.А., Сельков С.А. Содержание хемокинов и цитокинов в перитонеальной жидкости больных наружным генитальным эндометриозом различной степени тяжести. Медицинская иммунология. 2007; 9(1): 85-90.
  15. Sukhikh G.T., Sotnikova N.Y., Antsiferova Y.S., Posiseeva L.V., Veryasov V.N., Van’ko L.V. Cytokine production by immunocompetent cells of peritoneal fluid in women with external genital endometriosis. Bull. Exp. Biol. Med. 2004; 137(6): 568-71.
  16. Podgaec S., Rizzo L.V., Fernandes L.F., Baracat E.C., Abrao M.S. CD4(+) CD25(high) Foxp3(+) cells increased in the peritoneal fluid of patients with endometriosis. Am. J. Reprod Immunol. 2012; 68(4): 301-8.
  17. Barcz E., Milewski Ł., Dziunycz P., Kamiński P., Płoski R., Malejczyk J. Peritoneal cytokines and adhesion formation in endometriosis: an inverse association with vascular endothelial growth factor concentration. Fertil. Steril. 2012; 97(6): 1380-6.
  18. Yuhki M., Kajitani T., Mizuno T., Aoki Y., Maruyama T. Establishment of an immortalized human endometrial stromal cell line with functional responses to ovarian stimuli. Reprod. Biol. Endocrinol. 2011; 9: 104.
  19. Chan R.W., Mak A.S., Yeung W.S., Lee K.F., Cheung A.N., Ngan H.Y., Wong A.S. Human female reproductive tract epithelial cell culture. Methods Mol. Biol. 2013; 945: 347-63.
  20. Delbandi A.A., Mahmoudi M., Shervin A., Akbari E., Jeddi-Tehrani M., Sankian M. et al. Eutopic and ectopic stromal cells from patients with endometriosis exhibit differential invasive, adhesive, and proliferative behavior. Fertil. Steril. 2013; 100(3): 761-9.
  21. Huang F., Cao J., Liu Q., Zou Y., Li H., Yin T. MAPK/ERK signal pathway involved expression of COX-2 and VEGF by IL-1β induced in human endometriosis stromal cells in vitro. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2013; 6(10): 2129-36.
  22. Dominici M., Le B.K., Mueller I., Slaper-Cortenbach I., Marini F., Krause D. et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchimal stromal cells. The international society for cellular therapy position statement. Cytotherapy. 2006; 8: 315-7.
  23. Donnenberg A.D., Meyer E.M., Rubin J.P., Donnenberg V.S. The cell-surface proteome of cultured adipose stromal cells. Cytometry A. 2015; 87(7): 665-74.
  24. Uder C., Brückner S., Winkler S.., Tautenhahn H.M. Christ B. Mammalian MSC from selected species: Features and applications. Cytometry A. 2018; 93(1): 32-49.
  25. Bouquet De Jolinière J., Ayoubi J.M., Gianaroli L., Dubuisson J.B., Gogusev J., Feki A. Endometriosis: a new cellular and molecular genetic approach for understanding the pathogenesis and evolutivity. Front. Surg.2014; 1: 16.
  26. Borrelli G.M., Abrão M.S., Mechsner S. Can chemokines be used as biomarkers for endometriosis? A systematic review. Hum. Reprod. 2014; 29(2): 253-66.
  27. Sikora J., Mielczarek-Palacz A., Kondera-Anasz Z., Strzelczyk J. Peripheral blood proinflammatory response in women during menstrual cycle and endometriosis. Cytokine. 2015; 76(2): 117-22.
  28. Măluţan A.M., Drugan T., Ciortea R., Mocan-Hognogi R.F., Bucuri C., Rada M.P., Mihu D. Serum anti-inflammatory cytokines for the evaluation of inflammatory status in endometriosis. J. Res. Med. Sci. 2015; 20(7): 668-74.
  29. Malutan A.M., Drugan T., Costin N., Ciortea R., Bucuri C., Rada M.P., Mihu D. Pro-inflammatory cytokines for evaluation of inflammatory status in endometriosis. Cent. Eur. J. Immunol. 2015; 40(1): 96-102.
  30. Barcz E., Milewski Ł., Dziunycz P., Kamiński P., Płoski R., Malejczyk J. Peritoneal cytokines and adhesion formation in endometriosis: an inverse association with vascular endothelial growth factor concentration. Fertil. Steril. 2012; 97(6): 1380-6.
  31. Bersinger N.A., Dechaud H., McKinnon B., Mueller M.D. Analysis of cytokines in the peritoneal fluid of endometriosis patients as a function of the menstrual cycle stage using the Bio-Plex® platform. Arch. Physiol. Biochem. 2012; 118(4): 210-8.
  32. Hirata T., Osuga Y., Takamura M., Saito A., Hasegawa A., Koga K. et al. Interleukin-17А increases the secretion of interleukin-8 and the expression of cyclooxygenase 2 in endometriosis. Fertil. Steril. 2011; 96(1): 113-7.
  33. Urata Y., Koga K., Hirota Y., Akiyama I., Izumi G., Takamura M. et alIL-1β increases expression of tryptophan 2,3-dioxygenase and stimulates tryptophan catabolism in endometrioma stromal cells. Am. J. Reprod. Immunol. 2014; 72(5): 496-503.
  34. Ahn S.H., Edwards A.K., Singh S.S., Young S.L., Lessey B.A., Tayade C. IL-17A Contributes to the pathogenesis of endometriosis by triggering proinflammatory cytokines and angiogenic growth factors. J. Immunol. 2015; 195(6):2591-600.

Поступила 17.04.2019

Принята в печать 19.04.2019

Об авторах / Для корреспонденции

Павлович Станислав Владиславович, к.м.н., доцент, ученый секретарь ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Ттел.: +7 (495) 438-52-25.
Е-mail: s_pavlovich@oparina4.ru. Адрес: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
Кречетова Любовь Валентиновна, к.м.н., заведующий лабораторией клинической иммунологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России.
Тел.: +7 (495) 438-11-83. Е-mail: l_krechetova@oparina4.ru. Адрес: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
Вторушина Валентина Валентиновна, к.м.н., врач клинической лабораторной диагностики лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Тел.: +7(495) 438 11 83. Е-mail: v_vtorushina@oparina4.ru. Адрес: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
Ванько Людмила Викторовна, д.м.н., профессор, ведущий научный сотрудник лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова»
Минздрава России. Тел: +7 (495) 438 11 83. Е-mail: LVanko@oparina4.ru. Адрес: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
Мелкумян Арика Гагиковна, аспирант ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России, 117997 Москва, ул. Академика Опарина, д. 4, тел: +79639633755, е-mail: dr.melkumyan@gmail.com
Юшина Марина Николаевна, младший научный сотрудник лаборатории молекулярной патофизиологии отдела системной биологии в репродукции
ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Тел.: +7 (977) 9977193. Адрес:117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
Савилова Анастасия Михайловна, к.б.н., заведующая информационно-аналитическим центром по биомедицине НИИ трансляционной медицины ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова Минздрава России, ФГБОУ «ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова» Минздрава России.
Тел.: +7 (9017)5610536. Е-mail: 1savilova@gmail.com. Адрес: 117997, г. Москва,  ул. Островитянова, д. 1.
Макиян Зограб Николаевич, д.м.н., ведущий научный сотрудник гинекологического отделения отдела оперативной гинекологии и общей хирургии ФГБУ «НМИЦ АГП
им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Тел.: +7(495) 438-77-83. Е-mail: z_makiyan@oparina4.ru. Адрес: 117997 Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
Яроцкая Екатерина Львовна, доцент, д.м.н., заведующая отделом международного сотрудничества ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. , Тел.: +7(495) 438-1166. Е-mail: e_yarotskaya@oparina4.ru. Адрес: 117997 Москва, ул. Академика Опарина, д. 4
Хилькевич Елена Григорьевна, д.м.н., советник директора ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Тел.: +7 (926) 221-33-06.
Е-mail: e_khilkevich@oparina4.ru. Адрес: 117997 г. Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
Чупрынин Владимир Дмитриевич, к.м.н., заведующий отделом оперативной гинекологии и общей хирургии ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Тел.: +7 (495) 438-35-75. Е-mail: v_chuprynin@oparina4.ru. Адрес: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
Сухих Геннадий Тихонович, академик РАН, д.м.н., профессор, директор ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России. Тел.: +7 (495) 438-18-00.
Е-mail: e_khilkevich@oparina4.ru. Адрес: 117997 г. Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.

Для цитирования: Павлович С.В., Кречетова Л.В., Вторушина В.В., Ванько Л.В., Мелкумян А.Г., Юшина М.Н., Савилова А.М., Макиян З.Н., Яроцкая Е.Л., Хилькевич Е.Г., Чупрынин В.Д., Сухих Г.Т. Особенности профиля секретируемых белков клетками из эндометриоидных очагов и эутопического эндометрия женщин с наружным генитальным эндометриозом в культуре in vitro.
Акушерство и гинекология. 2019; 8:90-99.
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2019.8.90-99

Полный текст публикаций доступен только подписчикам

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь