Особенности профиля секретируемых белков клетками из эндометриоидных очагов и эутопического эндометрия женщин с наружным генитальным эндометриозом в культуре in vitro

Цель. Провести сравнительную оценку профиля секретируемых в культуре in vitro белков клетками из эндометриоидных очагов и эутопического эндометрия женщин с наружным генитальным эндометриозом.
Материал и методы. Клетки, выделенные из образцов эндометриоидных гетеротопий и эутопического эндометрия 21 женщины с наружным генитальным эндометриозом, и клетки эндометрия 8 женщин без эндометриоза культивировали in vitro. Поверхностный фенотип клеток, взятых после первого пассажа, определяли с помощью проточного цитофлуориметра и стандартного набора моноклональных антител. В кондиционированной среде культур во время 2-го пассажа определяли концентрацию различных растворимых аналитов с использованием мультиплексного анализа.
Результаты. Клетки из эндометриоидных очагов и эутопического эндометрия, культивированные до 2 пассажа, прилипали к пластику, имели фибробластоподобную морфологию, фенотипически соответствовали минимальным критериям, принятым для идентификации мезенхимальных стромальных клеток. В супернатантах культур выявлен различный уровень продукции исследованных белков клетками из очагов эндометриоза и эутопического эндометрия.
Заключение. Продукция in vitro широкого спектра белков, характеризующих функциональное состояние стромальных клеток, выделенных из эктопических очагов эндометриоза, указывает на состояние повышенной активации клеток в эндометриоидных очагах, что является важным патогенетическим фактором развития эндометриоза.

Наружный генитальный эндометриоз (НГЭ) — распространенное гинекологическое заболевание, при котором клетки эндометрия (внутреннего слоя стенки матки) разрастаются за пределами матки. Участие иммунной системы в патогенезе эндометриоза считается установленным [1–4]. К иммунным нарушениям при эндометриозе относят снижение реакций клеточной цитотоксичности в отношении клеток аутологичного эндометрия и развитие аутоиммунных реакций [5–8]. Для эндометриоза характерно развитие локального воспаления с системной субклинической манифестацией [9–12].

Для более полного понимания патогенеза НГЭ представляется важным изучение роли ангиогенных, нейрогенных, лимфоангиогенных факторов, цитокинов, хемокинов, различных ростовых факторов в формировании и прогрессировании очагов НГЭ. Исследование механизмов патогенеза и поиск диагностических маркеров НГЭ необходимы для разработки ранней неинвазивной диагностики и патогенетической терапии данного заболевания.

Самым распространенным материалом для изуче­ния патогенеза развития НГЭ является перитонеаль­ная жидкость, которую используют для изучения фенотипа и функционального состояния перитонеальных макрофагов, содержания цитокинов, хемокинов, различных ростовых факторов [13–17]. Однако получение перитонеальной жидкости возможно только при инвазивных вмешательствах, что значительно ограничивает возможности исследования.

Поэтому изучение патогенеза эндометриоза часто проводится с использованием экспериментальных моделей, в частности in vitro. В настоящее время уже создана иммортализованная линия эндометриоидных клеток человека KC02-44D, цитоскелет, экспрессия генов и биохимический фенотип которых сходны с таковыми у зародышевых эндометриальных стромальных клеток. Как предполагается, эта линия клеток может быть полезной в изучении эндометриальной функции и ассоциированных с ней патологий [18]. Описаны процедуры создания и поддержания первичных культур клеток поверхностного эпителия яичников, трубного эпителия и эндометрия человека, протоколы для иммортализации, клональной изоляции и сокультивирования со стромальными клетками, что может быть полезно для исследования молекулярной и клеточной функции этих видов эпителия в норме и при патологии [19].

Перспективным направлением представляется сравнительное исследование фенотипа и функциональной активности при культивировании in vitro клеток из эутопического эндометрия и очагов эндометриоза различной локализации [20, 21]. Целью настоящей работы являлась сравнительная оценка профиля секретируемых белков клетками из эндометриоидных очагов и эутопического эндометрия женщин с НГЭ в культуре in vitro.

Материал и методы

Образцы эутопического и эктопического эндометрия забирали во время малоинвазивных операций – лапароскопии в сочетании с гистероскопией у 21 пациентки с НГЭ, которые проходили стационарное лечение в отделении оперативной гинекологии и в хирургическом отделении ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации (РФ). Всем женщинам диагноз НГЭ был поставлен интраоперационно и подтвержден гистологически. У 18 пациенток были взяты парные образцы эутопического эндометрия и эндометриоидных гетеротопий. Контрольные образцы эндометрия были взяты у 8 пациенток, прооперированных по поводу миомы матки (n=3), неполной и полной внутриматочной перегородки (n=4), кисты яичника (n=1). Отсутствие эндометриоза у этих пациенток было подтверждено во время оперативного вмешательства по поводу основного заболевания.

Возраст пациенток, включенных в исследование, варьировал от 25 до 40 лет. От каждой пациентки было получено информированное согласие на проведение данного исследования.

Образцы эутопического эндометрия и очагов эндометриоза помещали в стерильные пробирки и немедленно транспортировали в лабораторию. Образцы тканей промывали раствором фосфатно-солевого буфера, механически измельчали и затем инкубировали в 0,07% растворе коллагеназы IА (Sigma-Aldrich, США) при 37 °С в течение 30 минут. Смесь центрифугировали при 2000 об./мин в течение 5 минут, надосадочную жидкость удаляли и осадок ресуспендировали в среде DMEM/F-12 («ПанЭко», РФ), содержавшей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, Великобритания), 50 Ед/мл пенициллина, 50 мкг/мл стрептомицина, 2 мМ L-глутамина («ПанЭко», РФ).

Полученную клеточную суспензию переносили в культуральные флаконы площадью 25 см2, плотность посева составляла 35×103 ядросодержащих клеток на 1 см2.

Поверхностный фенотип клеток, взятых после первого пассажа, определяли с помощью стандарт...

Павлович С.В., Кречетова Л.В., Вторушина В.В., Ванько Л.В., Мелкумян А.Г., Юшина М.Н., Савилова А.М., Макиян З.Н., Яроцкая Е.Л., Хилькевич Е.Г., Чупрынин В.Д., Сухих Г.Т.