Применение метода флуоресцентной гибридизации in situ в диагностике бактериального вагиноза

Бактериальный вагиноз (БВ) – полимикробный биопленочный вагинальный синдром, характеризующийся высокой распространенностью, частотой рецидивов и связанных с ними осложнений, включая преждевременные роды, бесплодие и более высокий риск развития инфекций, передаваемых половым путем. Традиционные методы диагностики, используемые для выявления заболевания, не дают полной информации о морфологии, количестве и пространственном расположении микроорганизмов, ассоциированных с БВ. Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) сочетает в себе точность молекулярной генетики и информативность микроскопии, что позволяет визуализировать взаимосвязи между бактериями в их естественной микросреде обитания, такой как биопленка при БВ. Персистенция биопленки, состоящей из ассоциированных с БВ микроорганизмов, является одним из самых вероятных путей возникновения рецидивов и является важным диагностическим маркером заболевания. В обзоре литературы представлены данные по истории использования метода FISH, приведены основные принципы данного метода и показаны преимущества в диагностике БВ, особенно его рецидивирующих форм.
Заключение: Использование метода FISH позволит не только изменить представление о патогенезе БВ, но и выявить этиологический агент у каждой конкретной женщины, диагностировать биопленочный/небиопленочный вагиноз, определив пространственное отношение бактерий друг к другу и к эпителиальным клеткам, прогнозировать развитие рецидива заболевания и с учетом этого подбирать соответствующую терапию.

Вклад авторов: Савичева А.М., Крысанова А.А. – обзор публикаций по теме статьи, анализ полученных данных, написание рукописи, одобрение окончательной версии статьи; Шалепо К.В., Спасибова Е.В., Будиловская О.В., Хуснутдинова Т.А., Тапильская Н.И., Свидзинская С. – редактирование текста, одобрение окончательной версии статьи; Коган И.Ю., Свидзинский А.В. – финальное редактирование текста и одобрение окончательной версии статьи. 
Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. 
Финансирование: Работа выполнена в рамках инициативной темы. 
Для цитирования: Савичева А.М., Крысанова А.А., Шалепо К.В., Спасибова Е.В., Будиловская О.В., Хуснутдинова Т.А., Тапильская Н.И., Коган И.Ю., Свидзинский А.В., Свидзинская С. Применение метода флуоресцентной гибридизации in situ 
в диагностике бактериального вагиноза.
Акушерство и гинекология. 2023; 12: 68-77
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2023.129

Главной целью применения любого метода диагностической микробиологии является быстрая и точная идентификация бактерий в их естественной среде. Это особенно важно для диагностики бактериального вагиноза (БВ) – полимикробного биопленочного вагинального синдрома, характеризующегося высокой распространенностью, высокой частотой рецидивов и связанных с ними осложнений, включая преждевременные роды, бесплодие и более высокий риск развития инфекций, передающихся половым путем [1].

Микроскопические методы являются первым этапом диагностики инфекций репродуктивного тракта. С использованием красителей (окраска по Граму, метиленовым синим) оценивают микробиоценоз гениталий с определением количества лейкоцитов, эпителия, соотношения лейкоцитов и эпителиальных клеток, слизи и морфотипов бактерий [2]. Эти методы быстрые и дешевые, сочетающие прямую визуализацию и ориентировочную характеристику бактерий на основе строения их клеточной стенки. Из-за того, что существует малое разнообразие морфологических различий между множеством бактерий, микроскопические методы не позволяют провести надежную идентификацию микроорганизмов.

Методы на основе культивирования требуют много времени и во многом являются избирательными, особенно в отношении прихотливых или трудно культивируемых бактерий. Кроме того, данный подход не отражает точного состава смешанных бактериальных сообществ или микробного разнообразия при различных инфекциях, что является важным моментом при БВ [3]. В последние годы молекулярные методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР) и последующая гибридизация или секвенирование, произвели революцию во всех областях микробиологии. Стало возможным количественное обнаружение и точная идентификация бактерий, в том числе и ассоциированных с БВ. Эти методы уже широко и успешно используются в клинической микробиологии для обнаружения медленно растущих организмов или микроорганизмов, которые трудно культивировать (Megasphaera spр. типы 1 и 2, Dialister spр. типы 1–3, Eggerthella spр. тип 1). Однако эти методы не дают полной информации о морфологии, количестве и пространственном расположении микроорганизмов и клеток.

Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) сочетает в себе точность молекулярной генетики и информативность микроскопии, что позволяет визуализировать взаимосвязи между бактериями в их естественной микросреде обитания, такой как биопленка при БВ.

В таблице представлены используемые методы диагностики БВ и их характеристики [4].

Метод FISH (метод флуоресцентной микроскопии) использует панель различныx флуоресцентно меченныx 16S рРНК зондoв для визуализации биопленки in situ и визуализации дисбактериозa in situ, что позволяет быстро и точно установить диагноз биопленочного вагиноза и небиопленочного вагиноза. Иными словами, метод позволяет сразу установить диагноз рецидивирующего вагиноза с образованием биопленок, при котором нужна двухэтапная, а иногда и трехэтапная терапия с разрушением биопленок, назначением антибактериальных препаратов и далее – пробиотических препаратов. С другой стороны, если в препарате выявляются рассеянные микроорганизмы, не образующие биопленки или формирующие ложные биопленки в виде псевдоключевых клеток (что, например, образуют лактобациллы, такие как L. iners), это может быть небиопленочный вагиноз, который не рецидивирует, и в этой ситуации терапия будет совсем другой.

При проведении этого исследования можно определять сразу разные виды микроорганизмов, генотипы гарднерелл, например, а также их отношение друг к другу и к эпителиальным клеткам и определять, находятся они в адгезивном или рассеянном состоянии.

История изучения вопроса

Метод гибридизации in situ, FISH, был разработан двумя исследовательскими группами независимо друг от друга [5, 6]. Исследователи описали новый подход к окрашиванию препаратов, основанный на комплементарном связывании нуклеотидного зонда, меченного радиоактивной меткой со специфическими мишенями – последовательностями нуклеиновых кислот внутриклеточных структур. Этот метод позволил исследовать последовательности нуклеиновых кислот внутри клеток без разрушения структуры самой клетки или нарушения целостности ее органоидов. Со временем метод гибридизации in situ совершенствовался, сфера применения метода расширялась, его использовали как для изучения эволюции хромосом, так и для анализа хромосом в целом, в том числе и для диагностики различных онкологический заболеваний, а также метод нашел широкое применение в цитогенетических исследованиях. Окончательно метод был введен в бактериологию в 1988 г., когда были использованы радиоактивно меченные рРНК-направленные олигонуклеотидные зонды для микроскопического обнаружения бактерий [7]. С помощью этой технологии в 1990-х гг. была описана идентификация Mycobacterium leprae и Helicobacter pylori в биоптатах тканей. Кроме того, метод гибридизации in situ широко применялся для демонстрации вирусов внутри клеток, включая такие вирусы как: вирус папилломы человека, герпеса, ветряной оспы...

Савичева А.М., Крысанова А.А., Шалепо К.В., Спасибова Е.В., Будиловская О.В., Хуснутдинова Т.А., Тапильская Н.И., Коган И.Ю., Свидзинский А.В., Свидзинская С.