Применение «мягкого» протокола сти­му­ля­­ции суперовуляции в программах вспомогательных ре­­про­­дуктивных технологий: эффек­тивность и безопасность

01.07.2012
1016

ФГБУ Научный центр акушерства гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздравсоцразвития России, Москва

Цель исследования. Оптимизация программы экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбриона (ЭКО и ПЭ) у пациенток с высоким риском развития синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) путем использования модифицированного «мягкого» протокола стимуляции суперовуляции.
Материал и методы. Обследованы 146 супружеских пар репродуктивного возраста, которые нуждались в проведении программы ЭКО. Первую группу (исследуемую) составили 75 пациенток, стимуляция суперовуляции которым была проведена с использованием «мягкой» схемы с 5-го дня менструального цикла (МЦ). Вторую группу (сравнения) составила 71 пациентка, стимуляция суперовуляции которой была проведена по стандартному протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона со 2–3-го дня МЦ. Сорока шести пациенткам из группы сравнения был произведен ПЭ в цикле стимуляции, у 25 пациенток в связи с высоким риском развития СГЯ произведена криоконсервация эмбрионов и их перенос в следующем МЦ.
Результаты исследования. У пациенток с высоким риском развития СГЯ при применении «мягкого» протокола стимуляции суперовуляции выявлено достоверное увеличение среднего числа зрелых ооцитов в 1,3 раза, эмбрионов «хорошего» качества – в 1,4 раза, несмотря на снижение общего числа полученных ооцитов в 1,6 раза по сравнению со стандартным протоколом. Достоверное повышение уровня экспрессии мРНК HLA-G1 в клетках фолликулярной жидкости в 3,4 раза, мРНК HLA-G5 – в 2,5 раза при применении «мягкого» протокола стимуляции по сравнению со стандартным, ассоциировано с благоприятным исходом программы ЭКО и ПЭ. У пациенток в программе ЭКО и ПЭ при неудачах имплантации в эндометрии в период «имплантационного окна» отмечено повышение экспрессии мРНК генов провоспалительных цитокинов: ФНО-α – в 5 раз, ИЛ-18 – в 3,2 раза, ИЛ-1β – в 6,2 раза в цикле, предшествующем стимуляции, что является неблагоприятным прогностическим признаком для наступления беременности. Применение «мягкого» протокола стимуляции суперовуляции позволило снизить частоту развития СГЯ в 1,8 раза по сравнению со стандартным. Повышение уровней рецепторов СЭФР 1 и 2 типа в день введения триггера овуляции в 1,3 раза, уровня СЭФР в день ПЭ в 1,2 раза при применении стандартного протокола по сравнению с «мягким» является прогностически значимым в развитии СГЯ. Частота наступления беременности из расчета на ПЭ при применении «мягкого» и стандартного протокола не имеет статистически значимых различий (36,5 и 32,7% соответственно). Эффективность применения «мягкого» протокола достоверно выше в 1,4 раза, чем при переносе криоконсервированных эмбрионов, полученных в результате отмены ПЭ при стандартном протоколе в связи с высоким риском СГЯ.
Заключение. Применение «мягкого» протокола стимуляции суперовуляции у пациенток с высоким овариальным резервом представляется целесообразным в связи с более высокой эффективностью, снижением медикаментозной, психологической и экономической нагрузки по сравнению с ПЭ, криоконсервированных в результате отмены переноса из-за высокого риска СГЯ при применении стандартного протокола.

В настоящее время актуальным является вопрос разработки более безопасных и приемлемых для пациента протоколов стимуляции яичников, которые позволили бы при минимальном риске терапии увеличить вероятность рождения живого здорового ребенка при одноплодной беременности [20].

Сейчас все большее число исследователей предпочитают модифицированные протоколы стимуляции, в том числе и так называемые «мягкие» протоколы [1, 7–9, 19, 20]. Особое значение выбор оптимального протокола стимуляции суперовуляции и стартовой дозы рекомбинантного ФСГ имеет у пациенток с высоким риском развития синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) [12, 15, 17]. Учитывая тенденции сегодняшнего дня, заключающиеся в снижении медикаментозной нагрузки и осложнений, возникающих в процессе стимуляции функции яичников, является чрезвычайно важным проведение анализа эффективности и безопасности применения данных протоколов стимуляции [7, 20].

В последние годы интерес исследователей также сконцентрирован на поиске прогностических критериев лечения бесплодия в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) путем анализа состава фолликулярной жидкости (ФЖ) каждого из аспирируемых фолликулов и поиске корреляций между концентрацией содержащихся в ней цитокинов, качеством полученных ооцитов, эмбрионов и частотой наступления беременности, а также путем определения молекулярно-биологических маркеров, ассоциированных с исходом программ ЭКО [3]. Оптимизация программы ЭКО и переноса эмбриона (ПЭ) у пациенток с высоким риском развития СГЯ путем использования модифицированного «мягкого» протокола стимуляции суперовуляции является актуальным и перспективным направлением современной репродуктологии, что и явилось целью настоящего исследования.

Материал и методы исследования

Были обследованы 146 супружеских пар репродуктивного возраста, которые нуждались в лечении бесплодия и проведении программы ЭКО. Из них І группу (исследуемую) составили 75 пациенток в
возрасте до 35 лет, которым стимуляция суперовуляции была проведена с использованием «мягкой» схемы с 5-го дня менструального цикла (МЦ). Группа І была поделена на 2 подгруппы: 54 пациентки – с мультифолликулярными яичниками, 21 пациентка – с синдромом поликистозных яичников (СПКЯ). Вторую группу (сравнения) составила 71 пациентка, стимуляция суперовуляции которой была проведена по стандартному протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона (ГнРГ)
со 2–3-го дня МЦ. Группа IІ поделена на 2 подгруппы: 46 пациенток – с мультифолликулярными
яичниками, 25 пациенток – с СПКЯ. Из группы сравнения 46 пациенткам был произведен ПЭ в цикле стимуляции, у 25 пациенток в связи с высоким риском развития СГЯ произведена криоконсервация эмбрионов и последующий их перенос в следующем МЦ.

Статистический анализ результатов проводили с использованием пакета прикладных программ
Statistica for Windows v. 7.0, StatSoft Inc (США). Статистически значимыми считали отличия при р<0,05 (95% уровень значимости) и при р<0,01 (99% уровень значимости). Связь между изучаемыми показателями оценивали по результатам корреляционного анализа с вычислением коэффициента
корреляции Спирмена (R) и последующим установлением его значимости по критерию t.

В работе были использованы следующие схемы стимуляции суперовуляции:
· стимуляция суперовуляции по стандартному протоколу с антагонистом ГнРГ проводилась со
2–3-го дня МЦ препаратом рекомбинантного фолликулостимулирующего гормона (рФСГ) в стартовой дозе 150 МЕ. Введение антагониста ГнРГ в дозе 0,25 мг осуществляли при достижении максимальным фолликулом диаметра 16 мм по день введения триггера овуляции включительно;
· стимуляция суперовуляции по «мягкому» протоколу начиналась с 5-го дня МЦ препаратом рФСГ в стартовой дозе 75 МЕ с последующим аналогичным введением антагониста ГнРГ.

Критерием назначения триггера овуляции (препарат хорионического гонадотропина –ХГ в дозе
8000–10000 МЕ) в обеих группах считали наличие в яичниках, по крайней мере, трех фолликулов
диаметром более 17 мм. Через 35–36 ч после введения триггера проводили трансвагинальную пункцию яичников с целью аспирации преовуляторных ооцитов.

Процедура ЭКО и ПЭ были аналогичны в обеих группах.

Критериями включения в исследование явились: возраст женщин до 35 лет, высокий овариальный
резерв; мультифолликулярные яичники; отсутствие оперативных вмешательств на яичниках у
пациенток без СПКЯ; патологии эндометрия, по данным ультразвукового исследования; тяжелых
соматических заболеваний, представляющих угрозу течению беременности и родов, субфертильная
сперма супруга.

Применяли стандартные методы лабораторных обследований перед программой ЭКО и ПЭ, а также специальные методы исследования:
1. Определение уровней сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР, VEGFA) и его
рецепторов 1 и 2 типов методом иммуноферментного анализа в сыворотке крови в день введения
препарата ХГ и в день ПЭ с целью прогнозирования риска развития СГЯ.
2. Пайпель-биопсия эндометрия была проведена на этапе подготовки к программе ЭКО и ПЭ на
7–8-й день МЦ и в период «имплантационного окна» с оценкой профиля экспрессии мРНК генов
цитокинов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в 34 образцах эндометрия, биоценоза
влагалища и степени контаминации эндометрия условно-патогенной флорой.
3. Оценка 87 образцов ФЖ, полученных при трансвагинальной пункции яичников по молекулярно-генетическим параметрам, осуществлена с использованием метода ПЦР в режиме реального
времени с определением спектра генов: фактора некрза опухоли α (ФНО-α), интерлейкина-2 (ИЛ-
2), ИЛ-10, ИЛ-6, ИЛ-1β, фактора, ингибирующего лейкемию (LIF) и его рецептора, трансфор-
мирующего фактор роста (TGF-β1), VEGFA121, VEGFA189, VEGFA165, антигенов тканевой совместимости (HLA-G5) и HLA-G1.

Результаты исследования и их обсуждение

Пациентки обеих групп достоверно не различались по возрасту, частоте экстрагенитальной патологии, перенесенных гинекологических операций, невынашиванию беременности. Пациентки с СПКЯ в обеих группах имели бóльшую длительность бесплодия, достоверно бóльший объем яичников, бóльшее число антральных фолликулов; значения лютеинизирующего гормона и антимюллерового гормона (АМГ) практически в 2 раза превышали те же показатели по сравнению с подгруппами пациенток без СПКЯ. Как известно, АМГ является информативным показателем, отражающим овариальный резерв [5, 6, 10, 19].

Далее были проанализированы основные показатели стимуляции суперовуляции при применении «мягкого» и стандартного протоколов c антагонистом ГнРГ (см. таблицу).

Таблица. Основные показатели стимуляции суперовуляции у пациенток исследуемых групп.

Во II группе больных средняя суммарная доза препарата рФСГ достоверно превысила в 1,4 раза
тот же показатель в I группе. В I группе число фолликулов, полученных ооцитов и общее число полученных эмбрионов было достоверно ниже, чем в группе сравнения. Однако доля зрелых ооцитов и число эмбрионов «хорошего» качества в исследуемой группе достоверно превысило те же показатели в группе сравнения и составило: 76,1% и 4,9 против 56,5% и 3,2 соответственно. Полученные данные согласуются с мнением M.F. Verberg [20], что несмотря на небольшое число получаемых ооцитов при
применении «мягкого» протокола стимуляции, они представляют более гомогенную группу
ооцитов хорошего качества, а не патологическое снижение ответа яичников на стимуляцию
[3, 4].

Принимая во внимание существующее представление о том, что этапы созревания яйцеклетки, развития эмбриона и имплантации являются цитокинзависимыми процессами и контролируются иммунной системой, поиск молекулярно-биологических маркеров, ассоциированных с исходом программ ЭКО, в настоящее время представляется актуальной проблемой.

В связи с этим на следующем этапе работы был проведен сравнительный анализ результатов молекулярно-генетического исследования 87 образцов ФЖ, полученных при трансвагинальной пункции яичников, и 34 образцов эндометрия, взятых путем пайпель-биопсии на этапе подготовки к программе ЭКО на 7-й день МЦ и в период «имплантационного окна».

Результаты исследования профиля экспрессии мРНК генов цитокинов в ФЖ у пациенток с высоким риском развития СГЯ показали, что при применении «мягкой» схемы стимуляции, в период «имплантационного окна» достоверно повышается уровень экспрессии мРНК HLA-G1 в 3,4 раза, мРНК
HLA-G5 – в 2,5 раза по сравнению со стандартным протоколом (рис. 1).

Уровень экспрессии мРНК генов цитокинов в ФЖ у исследуемых пациенток

Известно, что повышение уровня экспрессии мРНК HLA-G играет ключевую роль в процессе имплантации, поддерживает локальное иммуносупрессивное состояние и может быть ассоциировано
с благоприятным исходом программы ЭКО и ПЭ [16, 21].

Оценка профиля экспрессии мРНК генов цитокинов в ткани эндометрия показала, что у пациенток
в программе ЭКО и ПЭ при неудачах имплантации в эндометрий в период «имплантационного окна»
имеет место повышение экспрессии мРНК генов провоспалительных цитокинов: ФНО-α – в 5 раз,
ИЛ-18 – в 3,2 раза, ИЛ-1β – в 6,2 раза в цикле, предшествующем стимуляции (рис. 2), что может явиться неблагоприятным прогностическим признаком для наступления беременности.

Уровень экспрессии мРнК генов цитокинов в ткани эндометрия в период "окна имплантации"

Очевидно, что пациентки с высоким овариальным резервом имеют больше шансов на наступление
беременности, чем пациентки с бедным ответом. С другой стороны, при одновременном росте слишком большого числа фолликулов существенно повышается риск развития СГЯ. Частота развития СГЯ
в исследуемой группе была в 1,8 раз достоверно ниже, чем в группе сравнения и составила 12 и 22%
соответственно.

Рассматривая патогенез СГЯ, многие ученые делают акцент на ключевую роль системы СЭФР в повышении сосудистой проницаемости. В связи с тем что в группах обследованных пациенток в предыдущих циклах стимуляции были случаи развития СГЯ, представляется актуальным изучение возможных предикторов данного осложнения. В настоящем исследовании были определены уровни СЭФР и рецепторов СЭФР 1 и 2 типов в день введения ХГ и в день ПЭ у 83 из 146 пациенток, включенных в исследование.

В день ПЭ уровень СЭФР в группе сравнения в 1,2 раза превысил тот же показатель в исследуемой
группе и составил 431,8±52,4 и 351,6±53,1 пг/мл соответственно. В день введения овуляторной дозы
ХГ уровни рецепторов СЭФР-1 составили 96,8±2,3 и 81,4±2,7, а рецептора СЭФР-2 – 15742,2±482,3 и
13197,9±486,2 пг/мл в группе сравнения и в исследуемой группе соответственно. Установлена умеренная корреляционная связь между рецептором СЭФР 2 типа и развитием СГЯ в группе сравнения (rS=0,4, р=0,04); в исследуемой группе корреляции не выявлено. Так как в группе сравнения частота развития СГЯ была достоверно выше, чем в исследуемой группе, повышение уровней СЭФР и рецепторов СЭФР 1 и 2 типов может подтверждать их прогностическую роль в развитии данного синдрома, что согласуется с данными P. Peitsidis [2, 13].

На следующем этапе исследования была проведена сравнительная оценка эффективности реализации программы ЭКО у обследованных пациенток при применении «мягкого» и стандартного протоколов стимуляции суперовуляции. Частота наступления беременности на ПЭ при применении «мягкой» схемы стимуляции составила 36,5%, в группе с применением стандартного протокола – 32,7%, однако различия были статистически незначимы (p≥0,05). Различия в частоте наступления беременности могут быть обусловлены значительной долей циклов с ПЭ в исследуемой группе в отличие от группы сравнения, где частота отмены переноса в связи с риском развития СГЯ была выше.

В рамках профилактики СГЯ широкое применение получил метод криоконсервации эмбрионов и переноса их в полость матки в следующем МЦ с предварительной гормональной подготовкой эндометрия.

В связи с этим представилось важным провести оценку частоты наступления беременности в расчете
на 1 цикл ПЭ при применении «мягкой» схемы стимуляции и, в качестве альтернативы, при переносе
криоконсервированных эмбрионов у пациенток с высоким риском развития СГЯ. Все криоконсервированные эмбрионы, перенесенные в полость матки, были сходны по всем параметрам, криоконсервированы методом витрификации. У всех пациенток после цикла переноса остались криоконсервированные эмбрионы для переноса их в следующих циклах. В итоге выявлены достоверные различия в частоте наступления беременности на ПЭ в группе с применением «мягкой» схемы стимуляции суперовуляции по сравнению с группой, где переносили криоконсервированные эмбрионы (36,5 и 25,3% соответственно, р=0,03).

Таким образом, полученные в ходе выполнения исследования данные свидетельствуют о несомненной связи между определенными иммунными факторами в сыворотке крови, ФЖ и эндометрия и эффективностью реализации репродуктивной функции, что диктует необходимость поиска новых молекулярно-биологических маркеров на этапе подготовки к программе ЭКО и ПЭ и совершенствования правильного выбора протоколов стимуляции суперовуляции для различных групп пациенток. С целью снижения риска развития СГЯ без отсрочки ПЭ и связанных с этим психологической нагрузкой, дополнительным временем и затратами на проведение криоконсервации эмбрионов и самой процедуры криопереноса, у пациенток с высоким риском развития СГЯ представляется целесообразным применение «мягкого» протокола стимуляции.

Список литературы

1. Назаренко Т.А. Стимуляция функции яичников. – М. МЕДпресс-информ, 2008.
2. Павлович С.В., Бурлев В.А. Сосудисто-эндотелиальный фактор роста в патогенезе синдрома гиперстимуляции яичников // Акуш. и гин. – 2004. – № 2. – С. 11–13.
3. Baart E.B., Martini E., Van Opstal D. Screening for aneuploidies of ten different chromosomes in two rounds of FISH: a short and reliable protocol // Prenat. Diagn. – 2004. – Vol. 24. – P. 955–961.
4. Baart E.B., Martini E., Eijkemans M.J. Milder ovarian stimulation for in-vitro fertilization reduces aneuploidy in the human preimplantation embryo: a randomized controlled trial // Hum. Reprod. – 2007. – Vol. 22. – P. 980–988.
5. Broer S.L., Mol B.W., Hendriks D. The role of antimullerian hormone in prediction of outcome after IVF: comparison with the antral follicle count // Fertil. Steril. – 2009. – Vol. 91. – P. 705–714.
6. Elgindy E.A., El-Haieg D.O., El-Sebaey A. Anti-Mullerian hormone: correlation of early follicular, ovulatory and midluteal levels with ovarian response and cycle outcome in intracytoplasmic sperm injection patients// Fertil. and Steril. – 2008. – Vol. 89. – P. 1670–1676.
7. Fauser B.C., Devroey P. Why is the clinical acceptance of gonadotropin-releasing hormone antagonist cotreatment during ovarian hyperstimulation for in vitro fertilization so slow? // Fertil. and Steril. – 2005. – Vol. 83. – P. 1607–1611.
8. Gerris J.M. Single embryo transfer and IVF/ICSI outcome: a balanced appraisal // Hum. Reprod. Update. – 2005. – Vol. 11. – P. 105–121.
9. Heijnen E.M., Eijkemans M.J., De Klerk C. A mild treatment strategy for in-vitro fertilisation: a randomised non-inferiority trial //Lancet. – 2007. – Vol. 369. – P. 743–749.
10. Kwee J., Schats R., McDonnell J. Evaluation of anti-Mullerian hormone as a test for the prediction of ovarian reserve // Fertil. and Steril. – 2008. – Vol. 90. – P. 737–743.
11. Nargund G., Fauser B.C., Macklon N.S. Rotterdam ISMAAR Consensus Group on Terminology for Ovarian Stimulation for IVF. The ISMAAR proposal on terminology for ovarian stimulation for IVF // Hum. Reprod. – 2007. – Vol. 22. – P. 2801–2804.
12. Olivennes F. Ovarian hyperstimulation syndrome prevention strategies: individualizing gonadotropin dose // Semin. Reprod. Med. – 2010. – Vol. 28. – Р. 463–467.
13. Pau E., Alonso-Muriel I., Gomez R. Plasma levels of soluble vascular endothelial growth factor receptor-1 may determine the onset of early and late ovarian hyperstimulation syndrome // Hum.Reprod. – 2006. – Vol. 21. – P. 1453–1460.
14. Peitsidis P., Agrawal R. Role of vascular endothelial growth factor in women with PCO and PCOS: a systematic review // Reprod. Biomed. Online. – 2010. – Vol. 20. – P. 444–452.
15. Pelinck M.J., Vogel N.E., Hoek A. Minimal stimulation IVF with late follicular phase administration of the GnRH antagonist cetrorelix and concomitant substitution with recombinant FSH: a pilot study // Hum. Reprod. – 2005. – Vol. 20. – P. 642–648.
16. Rizzo R., Andersen A.S., Lassen M.R. Soluble human leukocyte antigen-G isoforms in maternal plasma in early and late pregnancy // Am. J. Reprod. Immunol. – 2009. – Vol. 62. – P. 320–338.
17. Sterrenburg M.D., Veltman-Verhulst S.M., Eijkemans M.J. et al. Clinical outcomes in relation to the daily dose of recombinant follicle-stimulating hormone for ovarian stimulation in in vitro fertilization in presumed normal responders younger than 39 years: a meta-analysis // Hum Reprod Update. – 2011. – Vol. 17, № 2. – P. 184–196.
18. Ubaldi F., Rienzi L., Baroni E. Hopes and facts about mild ovarian stimulation // Reprod. Biomed. Online. – 2007. – Vol. 14. – P. 675–681.
19. Van Disseldorp J., Lambalk C.D., Kwee J. Comparison of inter- and intra-cycle variability of anti-Mullerian hormone and antral follicle counts // Hum. Reprod. – 2010. – Vol. 25. – P. 221–227.
20. Verberg M.F., Macklon N.S., Nargund G. Mild ovarian stimulation for IVF // Hum. Reprod. Update. – 2009. – Vol. 15. –P. 13–29.
21. Vercammen M., Verloes A., Haentjens P. Can soluble human leucocyte antigen-G predict successful pregnancy in assisted reproductive technology? // Curr. Opin. Obstet. Gynecol. – 2009. – Vol. 21. – P. 285–290.

Об авторах / Для корреспонденции

Калинина Елена Анатольевна, д.м.н, заведующая отделением вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минзрава России.
Адрес:119997, Москва, ул. Академика Опарина,д.4
Телефон:8(495) 438-13-41
E-mail: e_kalinina@oparina4.ru

Березикова М.В. – аспирант отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минзрава России.
Адрес:119997, Москва, ул. Академика Опарина,д.4
Телефон:8(495) 438-13-41

Бурменская Ольга Владимировна – научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ «НЦ АГИП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России
Подрез Людмила Андреевна – врач-лаборант лаборатории клинической иммунологии ФГБУ «НЦ АГИП им. В.И. Кулакова» Минздравсоцразвития России
Адрес:119997, Москва, ул. Академика Опарина,д.4
Телефон: 8(495) 438-11-83

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь