Профиль локальной экспрессии генов ростовых факторов и цитокинов в эндометрии периода «имплантационного окна» при хроническом эндометрите

17.12.2014
1233

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, Москва

Цель исследования. Провести анализ профиля экспрессии генов ростовых факторов и цитокинов в эндометрии в период «имплантационного окна» при хроническом эндометрите у пациенток с бесплодием.
Материал и методы. 1-я группа – основная (n=39) женщины с верифицированным по данным гистологического исследования хроническим эндометритом, планирующие лечение в программе ЭКО. 2-я группа – сравнения (n=39) женщины с трубно-перитонеальным бесплодием без хронического эндометрита, планирующие лечение в программе ЭКО. Проанализирована экспрессия генов IGFBP1,VEGF,IL15, IL18 в период «окна имплантации», соответствующего дню менструального цикла ЛГ+7.
Результаты.У пациенток 1-й группы с хроническим эндометритом выявлено снижение экспрессии мРНК генов IGFBP1в 3,4 раза, IL15 в 1,5 раза, VEGFA в 1,5 раза, IL18 в 1,4 раза.
Заключение. У женщин с хроническим эндометритом в период «окна имплантации» в слизистой оболочке матки снижен уровень экспрессии мРНК генов, значимых для успешной имплантации: IGFBP1, VEGFA, IL15, IL18.

Эндометрий является специализированной гормонально регулируемой популяцией клеток, которая характеризуется рядом циклических морфологических и биохимических изменений, необходимых для создания оптимальных условий для развития эмбриона [1]. Нормальная анатомия полости матки и состояние эндометрия обеспечивают оптимальные условия для имплантации эмбриона и поддержания беременности. Любые отклонения в эндометрии способны повлечь за собой нарушения репродуктивной функции. Именно поэтому, по мнению многих исследователей, оценка состояния полости матки и эндометрия является необходимым этапом подготовки к программам вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) [2]. Эффективность программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) определяется многими факторами, в числе которых прежде всего качество полученных эмбрионов и восприимчивость эндометрия на этапе имплантации.

Хронический эндометрит занимает первое место в структуре патологических изменений эндометрия, его распространенность у женщин с бесплодием варьирует от 2,8 до 68%, достигая своего максимума при наличии трубно-перитонеального фактора бесплодия [3, 4].

У пациенток с неудачными попытками ЭКО и ПЭ в анамнезе частота хронического эндометрита колеблется от 30 до 60%, частота обнаружения полипов эндометрия составляет 13%, гиперплазии эндометрия – 10% [3].

Хронический эндометрит – клинико-морфологический синдром, при котором в результате персистирующего повреждения эндометрия инфекционным агентом возникают множественные вторичные морфофункциональные изменения, нарушающие циклическую биотрансформацию и рецептивность слизистой оболочки тела матки.

Многие авторы связывают хронический эндометрит с бесплодием неясного генеза, привычным невынашиванием беременности, самопроизвольными выкидышами и преждевременными родами [3, 5–7].

Гистологической верификацией диагноза является наличие в биоптатах эндометрия в первую фазу менструального цикла плазматических клеток [8–10]. Дополнительная морфологическая диагностика хронического эндометрита основана на выявлении очаговой лимфо-лейкоцитарной инфильтрации, эозинофилов, очагового фиброза стромы, склеротических изменений стенок спиральных артерий. Обсуждается возможность диагностики хронического эндометрита с помощью иммуногистохимических маркеров (в частности CD 138), пока не нашедших применения в рутинной практике ввиду увеличения экономических затрат [11, 12].

На сегодняшний день данные, касающиеся влияния хронического эндометрита на имплантацию эмбриона и эффективность попыток ЭКО, неоднозначны. Хронический эндометрит, по мнению одних авторов, часто ассоциируется с бесплодием и неудачными попытками ЭКО, по мнению других – не влияет на репродуктивную систему и успех программ ВРТ [3, 4, 13].

Внимание исследователей в последние годы сфокусировано на изучении мРНК экспрессии генов в эндометрии у пациенток с бесплодием, однако работы, посвященные изучению экспрессии генов при патологии эндометрия, единичны. Имеются данные о том, что в «окно имплантации» у пациенток с хроническим эндометритом экспрессия некоторых генов (маркеров ростовых факторов, апоптоза, цитокинов, матриксных металлопротеиназ, гемобоксных генов, эстрогенового и прогестеронового рецепторов) значительно отличается от экспрессии тех же генов у здоровых женщин, что обосновывает проведение дальнейших исследований в этом направлении [14].

Целью настоящего исследования стал анализ профиля экспрессии мРНК генов ростовых факторов инсулиноподобного фактора роста, связывающего протеин-1 (IGFBP1), эндотелиального фактора роста сосудов-А (VEGFA) и цитокинов: интерлейкина-15 (IL15), интерлейкина-18 (IL18) в эндометрии в период «имплантационного окна» при хроническом эндометрите у женщин с бесплодием.

Материал и методы исследования

Для достижения поставленной цели на базе ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России были обследованы 78 женщин репродуктивного возраста с трубно-перитонеальным фактором бесплодия, планирующих реализацию репродуктивной функции в программе ЭКО. Из них: 39 пациенток (1-я группа – основная) с верифицированным диагнозом хронического эндометрита и 39 пациенток (2-я группа – сравнения) с трубно-перитонеальным фактором бесплодия без хронического эндометрита.

Биопсию эндометрия проводили в амбулаторных условиях в день менструального цикла ЛГ+7, который определяли с помощью мочевого теста Clear Blue (Unipath Ltd, Великобритания), основанного на определении увеличения уровня ЛГ в моче. С помощью аспирационной кюретки Pipelle de Cornier (Laboratorie C.C.D., Франция) получали биоптат эндометрия и помещали в пробирки со средой для стабилизации РНК (лизирующий раствор из системы для выделения нуклеиновых кислот «ПРОБА-НК», «ДНК-Технология», Россия).

В биоптатах эндометрия проанализирована экс­­­­прес­­­сия  мРНК генов маркеров ростовых факторов (IGFBP1, VEGF) и цитокинов (IL15, IL18), учав­ствующих в процессах имплантации. Оценку уров­ня экспрессии мРНК проводили с помощью коли­чественной полимеразной цепной реакции с пред­варительной стадией обратной транс­крип­ции ОТ-ПЦР) в режиме реального времени коммер­ческими тест-системами («ДНК-Технология», Рос­сия). Реакция амплификации проводилась с помощью детектирующего амплификата ДТ-96 («ДНК-Тех­нология», Россия).

Нормировка уровня экпрессии генов выполнена с использованием метода сравнения индикаторных циклов (метод Δ∆Cq) по четырем референсным генам HPRT1, TBP, B2M, GUSB. В качестве меры центральной тенденции выбрана медиана (Me), а в качестве интервальной оценки – верхний (L) и нижний квартили (H). Результаты представлены в виде Ме (0,25–0,75). Медиана значения уровня экспрессии в группе сравнения было принята за единицу. Для оценки значимости межгрупповых различий применялся U-критерий Манна–Уитни для несвязанных совокупностей.

Результаты исследования и обсуждение

Возраст обследованных женщин не различался между группами и составил в среднем 31,94±0,5 года в 1-й и 30,98±0,5 года во 2-й группе. Длительность бесплодия колебалась от 1 года до 15 лет, не имела межгрупповых различий и составила в среднем 5,4±0,35 года. На момент обследования все пациентки имели регулярный ритм менструаций. При анализе данных было отмечено, что хронические воспалительные заболевания органов малого таза в анамнезе выявлялись у 21 пациентки 1-й группы и у 16 пациенток 2-й (53,9 и 41,0% соответственно), однако значения не достигли уровня статистической значимости.

Первичное бесплодие было выявлено у 16 женщин (41,0%) в 1-й группе и у 21 (53,9%) во 2-й. Вторичное бесплодие диагностировано у 23 пациенток (59,0%) 1-й группы и у 18 женщин (46,2%) 2-й. Анализ исходов предыдущих беременностей выявил более высокую частоту медицинских абортов (51,3 против 45,2%) и самопроизвольных выкидышей (21,2 против 16,4%) у пациенток 1-й группы.

Результаты исследования, касающиеся особенностей экспрессия мРНК генов, кодирующих провоспалительные цитокины (IL15, IL18) и факторы роста (IGFBP1, VEGF) в «окно имплантации» у пациенток с хроническим эндометритом, продемонстрировали их значительные отличия по сравнению с аналогичными показателями женщин без хронического эндометрита. Так, при хроническом эндометрите у пациенток 1-й группы экспрессия мРНК гена IGFBP1 была снижена в 3,4 раза (р=0,031), Ме=0,29 (0,1–3,3) по сравнению с женщинами 2-й группы, Ме=1 (0,2–41,1); экспрессия мРНК гена IL-15 снижена в 1,5 раза (р=0,034), Ме = 0,7 (0,3–1,2), во 2-й группе – Ме=1 (0,8–1,4); экспрессия мРНК гена VEGF-A – также снижена в 1,5 раза (р=0,034), Ме=0,7 (0,4–1,0), во 2-й группе – Ме=1 (0,5–1,5); экспрессия мРНК гена IL18 снижена в 1,4 раза (р=0,041) Ме=0,7 (0,5–1,2), во 2-й группе – Ме=1 (0,8–1,2) (рисунок).

Полученные в нашем исследовании данные подтверждают мнение многих авторов относительно отрицательного влияния хронического эндометрита на репродуктивную функцию женщины.

Несомненная роль цитокинов: лейкемия-ингибирующего фактора (LIF), IL-6, IL-11, IL-12, IL-15, IL-18 в процессах имплантации доказана в ранее выполненных исследованиях.

Результаты настоящего исследования также демонстрируют снижение в эндометрии экспрессии IL-15 в 1,5 раза у женщин с хроническим эндометритом. Биологические свойства IL-15 похожи на свойства IL-2, кроме того, показано, что в среднесекреторную фазу менструального цикла происходит переключение синтеза с IL-2 на IL-15 [15].

Согласно полученным нами данным, у женщин с хроническим эндометритом снижена экспрессия мРНК IL-18 в 1,4 раза по сравнению с пациентками без эндометрита. IL-18 – цитокин, принадлежащий к семейству IL-1, производится макрофагами и некоторыми другими клетками. IL-15 связывает рецепторы IL-18 и IL-12, тем самым стимулируя клеточный иммунитет. Вследствие этого естественные киллеры (NK клетки) и некоторые Т-клетки стимулируют выработку такого цитокина, как интерферон γ, который играет важную роль в активации макрофагов. Данные, касающиеся влияния IL-18 на рецептивность эндометрия, указывают на то, что отрицательным является как избыточное повышение его экспрессии, так и снижение [16].

Экспрессия различных факторов роста и их рецепторов наряду с цитокинами важна для процессов имплантации.

В нашем исследовании было выявлено уменьшение экспрессии мРНК VEGF-A в 1,5 раза при хроническом эндометрите по сравнению с данными женщин без хронического эндометрита. VEGFA  наиболее значимый регулятор васкулогенеза (образование эмбриональной сосудистой системы) и физиологического и патологического ангиогенеза (рост новых сосудов в уже существующей сосудистой системе). VEGFA играет главную роль в развитии ангиогенеза и обеспечении доставки кислорода в эндометрии, выполняет иммунорегулирующие функции [17]. Семейство эндотелиальных факторов роста включает VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D и плацентарный фактор роста, два трансмембранных рецептора – KDR (или Flk-1) и Flt-1 и один единственный растворимый рецептор (sFlt), который действует как антагонист VEGF.

Известно, что в эндометрии, кроме эпителиальных и стромальных клеток, источником VEGF служат скопления нейтрофильных гранулоцитов, которые непосредственным образом участвуют в пролиферации сосудов эндометрия [17]. В эндометрии VEGF был обнаружен в течение всего менструального цикла с увеличением уровня экспрессии от средней фазы пролиферации до секреторной. Это и соответствует наибольшей активности эндометриальных клеток. Снижение экспрессии эндотелиальных факторов роста в эндометрии может привести к неадекватной сосудистой перфузии и к нарушению рецептивности эндометрия и самопроизвольному выкидышу [17, 18].

М. Ольховская показала снижение в 3,2 раза уровня VEGF в эндометрии у женщин с безуспешными попытками ЭКО. Автором предложено рассматривать снижение содержания VEGF как прогностически неблагоприятный фактор исхода программы ВРТ, свидетельствующий о неполноценной функциональной активности эндометрия в период «имплантационного окна» [19].

Наряду со снижением экспрессии мРНК гена VEGF-A у женщин с хроническим эндометритом нами было выявлено снижение экспрессии мРНК гена фактора роста – IGFBP1в 3,4 раза. IGFBP1 относят к семейству эпидермальных факторов роста и рассматривают его как важный маркер имплантации. IGFBP1 образуется стромальными клетками, особенно во время их децидуализации. Экспрессия IGFBP1 контролируется несколькими факторами, включая инсулин и IGF.

В работе N.C. Douglas и соавт. было показано, что у пациенток с беременностями, наступившими в программе ЭКО, экспрессия мРНК гена IGFBP1 была значительна выше, чем в группе женщин с отрицательным результатом программы [20]. 
Таким образом, авторы делают вывод, что IGFBP1 является значимым маркером успешной имплантации в программе ЭКО и ПЭ.

В исследовании M.M. Elbehery и соавт. (2011) было выявлено снижение экспрессии мРНК гена IGFBP1 в среднесекреторную фазу менструального цикла у пациенток с полипом эндометрия перед гистероскопией по сравнению с экспрессией мРНК гена после гистероскопии и полипэктомии [21]. Известно также, что экспрессия IGFBP1 резко увеличивается во время беременности [22].

Структурные и молекулярные перестройки эндометрия при хроническом эндометрите характеризуются наличием клеток воспалительного инфильтрата, фибробластическими реакциями и изменениями в составе экстрацеллюлярного матрикса, апоптозом функционального слоя, вызывая тем самым неспособность эндометрия воспринимать регуляторные импульсы. Структурно-функциональные и молекулярные нарушения в эндометрии при хроническом эндометрите в период «окна имплантации» определяют исход имплантации и могут являться причиной бесплодия [23].

Заключение

В результате проведенного исследования установлено, что у женщин с хроническим эндометритом в период «окна имплантации» в слизистой оболочке матки снижен уровень экспрессии мРНК генов, значимых для успешной имплантации: IGFBP1, VEGF-A, IL-15, IL-18. Полученные результаты позволяют предположить, что ассоциация хронического эндометрита с бесплодием и привычным невынашиванием беременности может быть обусловлена нарушением рецептивности эндометрия.

Список литературы

1. Кондриков Н.И. Структурно-функциональные изменения эндометрия под воздействием стероидных гормонов. Практическая гинекология. 1999; 1: 20-5.
2. Fatemi H.M., Kasius J.C., Timmermans A., van Disseldorp J., Fauser B.C., Devroy P., Broekmans F.J. Prevalense of unsuspected uterine cavity abnormatilies diagnosed by office hysteroscopy prior to in vitro fertilization. Hum. Reprod. 2010; 25(8): 1959-65.
3. Jonston-Macananny E.B., Hartnett J., Engmann L.L., Nulsen J.C., Sanders M.M., Benadiva C.A. Chronic endometritis is a frequent finding in women with recurrent implantation failure after in vitro fertilization. Fertil. Steril. 2010; 93: 437-41.
4. Kasius J.C., Fatemi H.M., Bourgain C. et al. The impact of chronic endometritis on reproductive outcome. Fertil. Steril. 2011; 96: 1451-6.
5. Cicinelly E., de Ziegler D., Nicoletti R. et al. Chronic endometritis: correlation among hysteroscopic, histologic and bacteriologic findings in a prospective trial with 2190 consecutive office hysteroscopies. Fertil. Steril. 2008; 89(3): 677-84.
6. Kitaya K., Yasuo T. Abberent expression of selectin E, CXCL1, and CXCL13 in chronic endometritis. Mod. Pathol. 2010; 23: 1136-46.
7. Kitaya K. Prevalens of chronic endometritis in recurrent miscarriages. Fertil. Steril. 2011; 95: 1156-8.
8. Adegboyega P.A., Pey Y., McLarty J. Relationship between eosinophils and clinical endometritis. Hum. Pathol. 2010; 41: 33-7.
9. Matteo M., Cicinelli E., Greco P., Massenzio F., Baldini D., Falagario T. et al. Abnormal pattern of lymphocyte subpopulations in the endometrium of infertile women with chronic endometritis. Am. J. Reprod. Immunol. 2009; 61: 322-9.
10. Kitaya K., Yasuo T. Immunohistochemistrical and clinicopathological characterization of chronic endometritis. Am. J. Reprod. Immunol. 2011; 66(5): 410-5.
11. Kitaya K., Yasuo T. Inter-observer and intra-observer variability in immunohistochemical detection of endometrial stromal plasmacytes in chronic endometritis. Exp. Ther. Med. 2013; 5(2): 485-8.
12. Vicetti Miguel R.D., Chivukula M., Krishnamurti U. Limitations of the criteria used to diagnose histologic endometritis in epidemiologic pelvic inflammatory disease research. Pathol. Res. Pract. 2011; 207: 680-5.
13. Fatemi H.M., Popovic-Todorovic B., Amerycks L., Bourgain C., Fauser B., Devroey P. In vitro fertilization pregnancy in a patient with proven chronic endometritis. Fertil. Steril. 2009; 91(4): 1293. e9-11.
14. Di Pietro C., Cicinelli E., Gurlielmino M., Ragusa M., Farina M., Palumbo M., Cianci A. Altered ttanscriptional regulation of cytokines, growth factors, and apoptotic proteins in the endometrium of infertile women with chronic endometritis. Am. J. Reprod. Immunol. 2013; 69(5): 509-17.
15. Trophimov D.Y., Burmenskaya O.V., Ebzeeva M.V., Kalinina E.A., Mullabaeva S.M., Kuzmichev L.N., Sukhikh G.T. Markers associated with success and failure of embryo transfer (ET) during IVF program. J. Reprod. Immunol. 2009; 81: 7th European Congress on Reproductive Immunology. September 17-20, 2009, Maratthon, Greece: 157.
16. Laird S., Tuckerman E., Li T. Cytokine expression in the endometrium of women with implantation failure and recurrent miscarriage. Reprod. Biomed. 2006; 13: 13-23.
17. Demir R., Yaba A., Huppertz B. Vasculogenesis and angiogenesis in the endometrium during menstrual cycle and implantation. Acta Histochem. 2010; 112(3): 203-14.
18. Plaiser M. Decidualizacia and angiogenesis. Best Pract. Res. Clin. Obstet. Gynaecol. 2011; 25(3): 259-71.
19. Ольховская М.А. Комплексная оценка состояния эндометрия в программе ЭКО: автореф. дис. … канд. мед. наук. М.; 2007.
20. Douglas N.C., Thornton M.N., Nurudeen S.K., Bucur M., Lobo R.A., Sauer M.V. Differential expression of serum glycodein and insulin-like growth factor binding protein-1 in early pregnancy. J. Reprod. Sci. 2013; 20(11): 1376-81.
21. Elbehery M.M., Nouh A.A., Mohamed M.L., Alanwar A.A., Abd-Allah S.H., Shalaby S.M. Insulin-like growth factor binding protein-1 and glycodelin levels in uterine flushing before and after hysteroscopic polypectomy. Clin. Lab. 2011; 57(11-12): 953-7.
22. Larrson A., Palm M., Basu S., Axellson O. Insulin-like growth-factor binding protein-1 (IGFBP-1) during normal pregnancy. J. Gynecol. Endocrinol. 2013; 29(2): 129-32.
23. Коган Е.А., Демура Т.А. Молекулярные и морфологические аспекты нарушений рецептивности эндометрия при хроническом эндометрите. Архив патологии. 2012; 3: 15-7.

Об авторах / Для корреспонденции

Таболова Виктория Кимовна, аспирант отделения сохранения и восстановления репродуктивной функции ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (918) 827-58-28. E-mail: tabol93@rambler.ru
Корнеева Ирина Евгеньевна, д.м.н., в.н.с. отделения сохранения и восстановления репродуктивной функции ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (903) 593-97-48. E-mail: irina.korneeva@inbox.ru
Донников Андрей Евгеньевич, к.м.н., с.н.с. лаборатории молекулярно-генетических исследований ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-11-83. E-mail: donnikov@dna-technology.ru
Бурменская Ольга Владимировна, к.б.н., научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических исследований ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-11-83. E-mail: bourmenska@mail.ru
Маслова Майя Анатольевна, аспирант отделения вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (985) 242-08-40. E-mail: mayay2012@mail.ru
Смольникова Вероника Юрьевна, д.м.н., в.н.с. отделения вспомогательных репродуктивных технологий в лечении бесплодия ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (903) 723-08-47. E-mail: centr.eko@mail.ru

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь