Акушерство и Гинекология №5 / 2015
Пролиферативная и миграционная активность клеток трофобласта при преэклампсии
ФГБНУ Научно-исследовательский институт акушерства, гинекологии и репродуктологии им. Д.О. Отта, Санкт–Петербург
Цель исследования. Изучить пролиферацию и миграцию клеток трофобласта линии JEG-3 в присутствии факторов, секретируемых плацентой.
Материал и методы. Клетки трофобласта культивировали в присутствии секреторных продуктов плацент 3-го триместра физиологической беременности или беременности, осложненной преэклампсией. Пролиферацию и миграцию клеток оценивали при помощи культуральных методов и проточной цитофлуориметрии.
Результаты. В третьем триместре в плаценте секретируются факторы как стимулирующие, так и ингибирующие пролиферацию и миграцию клеток трофобласта. Эффект ингибиторов пролиферации и миграции трофобласта превалирует над эффектом стимуляторов. Эффект факторов, секретируемых плацентой, стимулирующих пролиферацию и миграцию клеток, снижен в случае плацент женщин с преэклампсией.
Заключение. Нарушение инвазии трофобласта при преэклампсии связано с изменением продукции плацентой факторов, контролирующих пролиферацию и миграцию этих клеток.
Ворсины хориона плаценты имеют внешнюю оболочку из синцитиотрофобласта, под которым находится один слой клеток цитотрофобласта [1]. Синцитиотрофобласт представляет собой единую многоядерную структуру, покрывающую плодовые клетки и первым инвазирующим в матку [2]. Клетки синцитиотрофобласта выполняют трофическую функцию до установления гематотрофного типа питания, а также выполняют такие функции, как обмен кислородом, питательными веществами между организмом матери и плодом, выведение метаболитов, синтез гормонов, формирование иммунологической толерантности, защита сосудистой системы плода [3]. Трофобласт в первом триместре дифференцируется в несколько морфологически и функционально различных типов клеток. При этом основной характеристикой трофобласта первого триместра является высокая степень его пролиферации, миграции и инвазии в децидуальную оболочку. Надзор за пролиферацией и миграцией трофобласта, их ограничение и регуляцию осуществляют клетки плаценты, а также клетки иммунной системы матери, локализованные в децидуальной оболочке. Цитокины, ростовые факторы и ферменты, секретируемые в плаценте клетками трофобласта, клетками плаценты и децидуальной оболочки, оказывают паракринное и аутокринное влияние на функциональную активность трофобласта и их взаимодействие с клетками микроокружения. Эти взаимодействия лежат в основе контроля развития плаценты, ограничения избыточного роста и поддержания иммунологической толерантности в системе мать-плод. В третьем триместре беременности на первый план выступают механизмы, ограничивающие пролиферацию и миграцию клеток трофобласта при одновременном поддержании их жизнеспособности, ведущую роль в которых играют клетки микроокружения, в том числе децидуальные NK-клетки и макрофаги материнского происхождения. Полагают, что эти механизмы связаны с изменением цитокинового профиля в зоне маточно-плацентарного контакта.
В настоящее время достаточно полно описана продукция цитокинов плацентой как при физиологической беременности, так и при различных акушерских патологиях, включая преэклампсию [4]. Вместе с тем остаются недостаточно изученными механизмы, обеспечивающие поддержание функциональной активности при одновременном ограничении пролиферации трофобласта в третьем триместре физиологической беременности. Нарушение иммунологической толерантности в системе мать-плод и сбалансированной продукции цитокинов клетками микроокружения в зоне маточно-плацентарного контакта, а также связанная с этим неадекватная инвазия трофобласта лежат в основе таких осложнений беременности, как преэклампсия и привычное невынашивание. Однако в настоящее время недостаточно данных об изменении функциональной активности клеток трофобласта, не созданы модели, отражающие влияние факторов, секретируемых плацентой при преэклампсии на пролиферацию и миграцию клеток трофобласта.
Целью настоящего исследования стало изучение пролиферации и миграции клеток трофобласта линии JEG-3 в присутствии факторов, секретируемых плацентой в третьем триместре при физиологической беременности и при преэклампсии.
Материал и методы исследования
Культура клеток. Использовали клетки трофобласта линии JEG-3, полученные из Американской коллекции типовых культур (ATCC, США), воспроизводящие основные характеристики трофобласта [5]. Их культивировали в среде DMEM с добавлением 10% инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС), 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, 0,5 мМ L-глутамина, 1 мл MEM, 1 мМ пирувата натрия (Sigma, США). Дезинтеграцию монослоя клеток для пересева осуществляли раствором версена и раствора трипсина, смешанных в соотношении 1:1. Пересев клеток осуществляли 3 раза в неделю. При помощи раствора трипанового синего оценивали жизнеспособность клеток, при этом она составляла не менее 96%.
Культивирование фрагментов плацент. Использовали плаценты женщин, у которых беременность протекала без осложнений на сроке 38–39 недель (n=32, группа 1), плаценты женщин с беременностью, осложненной преэклампсией на сроке 38–39 недель (n=34, группа 2). Получено информированное согласие пациенток на обследование плаценты.
Фрагменты плацентарной ткани из центральной части плаценты культивировали в питательной среде DMEM без добавления ЭТС в течение 24 ч. Затем кондиционированные среды собирали и замораживали при температуре -20˚С до исследования.
Пролиферативную активность клеток трофобласта линии JEG-3 оценивали при помощи метода, основанного на окраске белковых компонентов цитоплазмы клеток витальным красителем кристаллическим фиолетовым. Указанный метод по чувствительности сопоставим с другими методами оценки пролиферативной активности. Клетки линии JEG-3 помещали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета для адгезионных культур (Sarstedt, Австрия) в концентрации 4000 клеток на лунку в 100 мкл среды DMEM c добавлением 2% ЭТС (Sigma, США) и культивировали сутки при 37˚С во влажной атмосфере и 5% СО2 для прикрепления их к поверхности планшета. Вносили кондиционирова...
