Акушерство и Гинекология №2 / 2020
Разработка и опыт использования транскрипционной сигнатуры генов в диагностике молекулярных подтипов рака молочной железы
1) ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия;
2) ООО «НПФ ДНК-Технология», Москва, Россия
Цель. Разработка и клиническая апробация отечественной транскрипционной сигнатуры генов для диагностики молекулярных подтипов рака молочной железы.
Материалы и методы. В исследование включены 168 женщин больных раком молочной железы (РМЖ) в возрасте от 29 до 82 лет, получивших лечение в отделении патологии молочной железы ФГБУ «НМИЦ АГиП им. В.И. Кулакова». Проведено патоморфологическое исследование операционного материала, иммуногистохимическое (ИГХ)-исследование опухолей (Ki67, ER, PR, HER2/neu), определение экспрессионного профиля 45 генов пролиферации, апоптоза, инвазии, рецепторов гормонов и ростовых факторов, репликации и репарации ДНК, иммунитета, факторов транскрипции и маркеров дифференцировки клеток методом количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.
Результаты. Установлены основные закономерности экспрессии мРНК исследованных генов для различных подтипов РМЖ и их корреляционные связи, разработаны и апробированы способы молекулярно-генетической классификации опухолей молочной железы в сравнении с традиционным ИГХ-исследованием.
Заключение. Разработанная транскрипционная сигнатура генов отражает гетерогенность опухолей молочной железы и может быть использована для их молекулярно-генетической классификации.
Рак молочной железы (РМЖ) занимает первое место в структуре онкологических заболеваний у женщин. Ежегодно в мире регистрируется свыше 2 млн новых случаев, одновременно смертность в 2018 г. составила 626 679 случаев [1].
РМЖ представляет гетерогенную группу заболеваний, обусловленных различными молекулярными свойствами опухолей. Основу современной классификации злокачественных опухолей молочной железы положила работа Perou C. и соавт. 2000 г., в которой при исследовании относительно небольшого числа образцов (n=65) с использованием микроматричного анализа 8102 генов были выделены четыре молекулярных (транскрипционных) подтипа РМЖ: базальноподобный, HER2-обогащенный, люминальный и вариант с экспрессией «нормального» генного профиля [2]. В результате дальнейших исследований было установлено, что профили экспрессии мРНК (транскрипционные профили) генов человека адекватно отражают биологическую гетерогенность РМЖ и могут применяться для молекулярной классификации опухолей c целью прогноза рецидива заболевания и выбора адъювантной терапии. В итоге были разработаны диагностические тест-системы, такие как Oncotype DX [3], MammaPrint [4], PAM50/Prosigna [5] и другие.
В 2011 г. подтипы РМЖ, определяемые при анализе экспрессии генов, были включены в соглашение международной группы экспертов Санкт-Галленской конференции по РМЖ (2011 St Gallen International Expert Consensus), однако в силу высокой стоимости исследования была предложена суррогатная (заменяющая истинную транскрипционную) классификация методом иммуногистохимического анализа (ИГХ) на основе определения экспрессии 4 генов: ER, PR, HER2/neu и KI67 [6].
В настоящее время методом ИГХ выделяют пять молекулярных подтипов РМЖ: люминальный А (ЛюмА), люминальный В HER2/neu – позитивный (люмВ Her2+), люминальный В HER2/neu – негативный (люмВ Her2-), HER2/neu – обогащенный (Her2+) и трижды негативный (ТН), характеристика которых хорошо представлена в работе Кулигиной Е.Ш. [7].
Несмотря на широкое использование в рутинной практике суррогатного метода ИГХ для определения подтипов РМЖ, истинный молекулярный подтип определяют транскрипционные сигнатуры генов, тем самым обеспечивая более надежный прогноз риска рецидива заболевания и выбор адъювантной терапии по сравнению с клиническими и ИГХ-прогностическими факторами [8]. Дискордантные результаты между ИГХ и молекулярно-генетической классификациями составляют от 8 до 30%, а это значит, что трети пациентов назначается некорректное лечение [9].
В связи с этим цель настоящего исследования состояла в разработке и апробации на клиническом материале отечественной транскрипционной сигнатуры генов для диагностики молекулярных подтипов РМЖ.
Материалы и методы
Для реализации поставленной цели была разработана транскрипционная панель, включающая 48 генов ESR1, PGR, AR (группа рецепторов гормонов), ERBB2, GRB7, EGFR, FGFR4 (группа рецепторов ростовых факторов), MKI67, MYBL2, CCNB1, AURKA, BIRC5, MYC, CCND1, CCNE1, CDKN2A, KIF14, PPP2R2A, PTTG1, SFRP1, TMEM45B, TMEM45A, TPX2 (группа генов, регулирующих пролиферацию, митоз, формирование веретена деления и регуляцию клеточного цикла), MMP11, CTSL2, EMSY, PAK1, ANLN (группа генов, регулирующих миграцию клеток, инвазию, организацию цитоскелета), BCL2, BAG1, PTEN (гены апоптоза), TYMS, EXO1, UBE2T, TPT1 (группа генов, регулирующих репликацию и репарацию ДНК), SCGB2A2, KRT5, MIA (маркеры дифференцировки клеток и коэкспрессированные с ними гены), GATA3, FOXA1, ZNF703, NAT1, (факторы транскрипции), CD68, TRA, CD274/PD-L1 (гены иммунной системы) и референсные гены B2M, GUSB, HPRT1. Транскрипционный профиль генов определяли методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в реальном времени»с использованием оригинальных праймеров и флуоресцентно-меченных проб (Fam, Cy5), специфичных к последовательностям, определяемым РНК. Использованы олигонуклеотиды, не амплифицирующие с матриц геномной ДНК, с размером ампликонов до 100–120 пар нуклеотидов, так как в парафинизированных образцах большая часть РНК имеет длину 100–300 оснований. Использованы реактивы и детектирующие амплификаторы ДТпрайм (ООО «НПФ ДНК-Технология», Россия).
В исследование включены 168 больных РМЖ в возрасте от 29 до 82 лет, получивших лечение в отделении патологии молочной железы ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» в период с октября 2016 по июль 2018 г.
Критерием включения был инвазивный РМЖ. К критериям исключения о...
