Результаты предимплантационной диаг­ностики FISH-методом супружеских пар с нормальным кариотипом

01.08.2010
905

ФГУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И.Кулакова Минздравсоцразвития РФ, Москва

Предымплантационная диагностика (ПД) с использованием молекулярно-цитогенетического FISH-метода проведена у 37 супружеских пар, страдающих бесплодием, в 41 цикле стимуляции суперовуляции. Частота анеуплоидии у эмбрионов по хромосомам 13, 21 составила 38,2%, при исследовании хромосом X, Y, 21—30,4%. Установлено, что при одновременной анеуплоидии различных хромосом несоответствие по морфологическому строению отмечается чаще, чем при анеуплоидии одной хромосомы: от 37,5% (при исследовании хромосом X, Y, 21) до 40% (при исследовании хромосом 13,21) против соответственно 16,7 и 35%. Использованный метод ПД является высокоэффективным для профилактики рождения генетически больного потомства.

Предымплантационная диагностика (ПД) направлена на выбор генетически здоровых эмбрионов in vitro и их перенос в полость матки женщины в рамках программы экстракорпорального оплодотворения (ЭКО).

Изначально ПД стала применяться для супружеских пар, имеющих высокий риск рождения ребенка с X-сцепленными заболеваниями и включенных в программу ЭКО [2, 3].

Дальнейшее развитие методов ПД позволило использовать ее не только для определения пола, но и для выявления анеуплоидий, хромосомных транслокаций, генных мутаций [1, 4, 7]. Перенос эмбрионов без хромосомных нарушений может повысить эффективность программ ЭКО и предупредить рождение больных детей в этой группе пациентов.

Цель исследования — определить частоту анеуплоидий хромосом 13 и 21, X, Y, 21 у эмбрионов супружеских пар с нормальным кариотипом, включенных в программы вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).

Материал и методы исследования

Исследование проведено на эмбрионах 37 супружеских пар с бесплодием в 41 цикле стимуляции суперовуляции.

У 15 супружеских пар ПД эмбрионов была проведена с исследованием хромосом 13, 21 в 19 циклах ВРТ. У одной супружеской пары было проведено 3 цикла ВРТ, у одной — 2. Средний возраст пациенток в этой группе составил 36 лет. Показаниями к проведению диагностики были возраст супругов и в ряде случаев желание самих пациенток (1-я группа).

У 22 супружеских пар в 22 циклах ВРТ была проведена ПД с исследованием хромосом Х, Y и21. Средний возраст пациенток в этой группе составил 34,7 года (2-я группа). Доля женщин в возрасте старше 35 лет в 1-й группе составила 50,4%, во 2-й группе — 34,9%.

Биопсию бластомеров проводили на 3-й день развития эмбриона in vitro. Для диагностики и последующего переноса выбирали эмбрионы, имеющие 6-10 бластомеров и фрагментацию не более 50%. Эмбрионы с фрагментацией бластомеров более 50% в ряде случаев подвергали биопсии по просьбе пациентов.

В качестве основы подготовки ядра и гибридизации in situ служил протокол, рекомендуемый фирмой-производителем. В ходе исследования данный протокол нами был оптимизирован.

Для идентификации хромосом в ядрах бластомеров применяли зонды фирмы «ABBOTТ» (Vysis, каталожные номера: 05J38-010, 32-131023, 32-132024, 32-190002). Микроскопический анализ проводили при увеличении 100×10 с использованием флюоресцентного микроскопа Axioplan 2 фирмы «Zeiss», оборудованного соответствующим набором фильтров фирмы «ABBOTТ» (Vysis) и системой автоматического анализа изображения ISIS, разработанной фирмой «Metasystems».

Результаты исследования и обсуждение

В 1-й группе после проведения ПД перенос эмбрионов был осуществлен в 18 циклах стимуляции суперовуляции (из–за отсутствия цитогенетически здоровых эмбрионов у 1 пациентки перенос был отменен).

Среднее количество эмбрионов, пригодных для переноса, равнялось двум. У7 женщин беременность наступила с первой попытки (36% на цикл или 38% на перенос). У 1 пациентки при переносе 3 эмбрионов была получена беременность тройней. Однако в I триместре 1 плод саморедуцировался.

Несмотря на проведение диагностики, в одном наблюдении беременность в I триместре была прервана в связи с обнаружением анэмбрионии плода (кариотип хориона 46,ХХ) при УЗИ. У 1 пациентки при УЗИ плода во II триместре беременности выявлена гипоплазия почек. Беременность по решению женщины была сохранена, ее исход неизвестен. Остальные беременности закончились родами здоровыми детьми.

Всего в 19 циклах стимуляции суперовуляции было получено 136 ооцитов, из которых после оплодотворения развились 112 (82,4%) эмбрионов, из них пригодных по качеству для диагностики и перспективных для последующего переноса было 80 (71,4%). Однако мы исследовали все доступные для ПД эмбрионы. Биопсия произведена у 107 эмбрионов хорошего и плохого качества. Для диагностики оказались пригодными 74 ядра (часть бластомеров не содержала ядер, часть была многоядерной).

При исследовании 74 ядер из одноядерных бластомеров результат был получен в 68 (91,9%) (рис. 1, см. на вклейке). При этом нормальный набор хромосом определен в 42 (61,8%) ядрах, а в 26 (38,2%) отмечены различные типы анеуплоидии (см. рис. 1). Нарушение числа хромосомы 21 наблюдали в 11 ядрах из 26, при этом трисомия хромосомы 21 выявлена в 6 наблюдениях. Анеуплоидия хромосомы 13 имела место в 10 из 26 наблюдений, из них трисомия обнаружена в 2.

Одновременное присутствие анеуплоидии хромосом 13 и 21 выявлено в 5 (19,2%) из 26 наблюдений. Среди эмбрионов с хромосомной патологией только 3 (11,5%) из 26 морфологически не соответствовали третьему дню развития.

Из 5 эмбрионов с одновременным присутствием анеуплоидий по разным хромосомам у 2 обнаружены отклонения в морфологическом строении.

Средний возраст женщин, у которых были выявлены эмбрионы с трисомией хромосомы 21, составил 32,2 года. У 1 пациентки в возрасте 31 года выявлено 2 эмбриона с данной трисомией. При наличии эмбрионов с трисомией хромосомы 13 (2 наблюдения) возраст женщины составил 35 лет.

Следует отметить, что из 6 эмбрионов с трисомией хромосомы 21 только один эмбрион морфологически не соответствовал третьему дню развития, а оба эмбриона с трисомией хромосомы 13 не имели отклонений.

После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие пригодных для переноса эмбрионов наблюдали в 83% случаев.

Во 2-й группе ПД эмбрионов на анеуплоидию хромосом X, Y, 21 была проведена у супружеских пар, страдающих вторичным бесплодием. У части супружеских пар ранее проводили лечение бесплодия методами ВРТ.

Перенос эмбрионов осуществлен в 20 циклах, в 2 случаях переноса не было в связи с отсутствием цитогенетически здоровых эмбрионов. Среднее количество эмбрионов, пригодных для переноса, составило 2, беременность наступила у 6 женщин (27,3% на цикл, 30% на перенос). У 3 пациенток диагностирована беременность двойней, у одной из них в I триместре произошла саморедукция одного плода.

Всего в 22 циклах было 210 ооцитов, из которых после оплодотворения было получено 150 (71,4%) эмбрионов. Пригодных по качеству для диагностики было 114 (76%) эмбрионов. Биопсия была произведена у 143 эмбрионов морфологически нормального строения и у эмбрионов, морфологически не соответствовавших третьему дню развития.

При исследовании 107 ядер из одноядерных бластомеров результат был получен в102 (95,3%). Среди 102 проанализированных ядер 71 содержало нормальный набор изучаемых хромосом, что составило 69,6%, в 31 (30,4%) отмечены различные типы анеуплоидии (рис. 2, см. на вклейке).

Изменения в комплексе гоносом выявлены в 11 ядрах из 31, при этом трисомия по половым хромосомам была отмечена в 6 наблюдениях (в 4 случаях — XXY, в 2 случаях — ХХХ), тетрасомию и моносомию хромосомы Х наблюдали в 2 случаях, в 1 наблюдении обнаружена моносомия хромосомы Y.

Анеуплоидия хромосомы 21 обнаружена в 12 (38,7%) наблюдениях из 31, из них трисомия и моносомия были представлены в равных долях (по 6 наблюдений).

Одновременное присутствие анеуплоидии гоносом и хромосомы 21 было выявлено в 8 (25,8%) наблюдениях из 31.

Возраст женщин, у которых были выявлены эмбрионы с трисомией хромосомы 21, варьировал от 36 до 43 лет, в среднем составил 40,2 года. У 1 женщины 38 лет выявлено 2 эмбриона с данной трисомией.

Из 6 эмбрионов с трисомией хромосомы 21 не соответствовали нормам морфологического строения 2 эмбриона. Среди эмбрионов с анеуплоидией гоносом 3 из 11 морфологически не соответствовали третьему дню развития.

Среди эмбрионов с одновременной анеуплоидией разных хромосом отмечено самое большое число эмбрионов с отклонениями в морфологическом строении (3 из 8).

После проведения процедуры забора бластомера дальнейшее развитие пригодных для биопсии эмбрионов наблюдали в 84% случаев.

ПД в клинической практике для исключения рождения генетически больного ребенка должна стать неотъемлемой частью ВРТ. Однако при проведении ПД у женщин старше 35 лет мы отметили ряд проблем. С одной стороны, учитывая возраст пациенток и высокий риск рождения ребенка с генетическими нарушениями, необходимость проведения ПД не вызывает сомнений. С другой стороны, у женщин старшего репродуктивного возраста в программе ВРТ получают мало эмбрионов, а их качество нередко не подходит для проведения ПД.

Проведенное исследование показало, что эмбрионы, имеющие в хромосомном наборе анеуплоидии, нередко (71‒88,5%) могут быть морфологически нормальными. При отсутствии проведения генетического исследования их можно было бы в дальнейшем использовать в программе ВРТ. Так, эмбрионы с трисомией хромосомы 21 имеют отклонения в морфологическом строении только в 16,7 — 33% наблюдений, в остальных наблюдениях они вполне соответствуют критериям визуального отбора для переноса в полость матки.

Среди эмбрионов с одновременной анеуплоидией различных хромосом несоответствие по морфологическому строению отмечается чаще, чем при анеуплоидии одной хромосомы: от 37,5 (при исследовании хромосом Х,Y, 21) до 40% (при исследовании хромосом 13, 21) против 16,7 и 33% соответственно. Такого же мнения придерживаются и другие авторы. По результатам исследования V. Baltaci и соавт. [6], 36,1% эмбрионов, визуально соответствовавших морфологическим нормам, могут иметь генетические нарушения.

Средний возраст женщин, у которых при исследовании хромосом 13 и 21 выявлена анеуплоидия хромосомы 21, составил 32,2 года. В связи с этим мы считаем, что проведение ПД с исследованием эмбрионов на различные типы анеуплоидии можно предлагать всем пациентам программы ВРТ в виде скрининга. Женщинам старше 35 лет следует обязательно рекомендовать ПД при наличии достаточного количества эмбрионов визуально нормального морфологического строения. Уже показано, что у женщин после проведения скрининга эмбрионов частота наступления беременности выше, чем у женщин, у которых такой анализ не проводили. По мнению многих авторов, селекция и перенос эмбрионов с нормальным хромосомным набором увеличивают частоту имплантации, снижают риск спонтанных абортов и предупреждают рождение детей с генетической патологией при проведении программы ВРТ [4-6].

Список литературы

1. Delhanty J. Multicolor FISH frequent chromosomal mosaicism and chaotic division in preimplantation embryos from fertile patients // Hum. Genet. — 1997. — Vol. 99. — № 6. — P. 755—760.

2. Edwards R., Gardner R. Sexing of live rabbit blastocysts // Nature. — 1967. — Vol. 214. — P. 567—577.

3. Handyside A. et al. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification // Nature. — 1990. — Vol. 344. — P. 768— 770.

4. Harper J. International data collection // Reprod. Biomed. Online. — 2005. — Vol. 10. — № 2. — P. 5—6.

5. Harper J. et al. ESHRE PGD Consortium data collection V: Cycles from January to December 2002 with pregnancy follow-up to October 2003 // Hum. Reprod. — 2006. — Vol. 21. — № 1. — P. 3—21.

6. Munne S. et al. Preimplantation genetic diagnosis significantly reduces pregnancy loss in infertile couples: a multicenter study // Fertil. Steril. — 2006. — Vol. 85. — № 2. — P. 326—332.

7. Staessen C.et al. Clinical experience of sex determination by fluorescent in-situ hybridization for preimplantation genetic diagnosis // Molecular Hum. Reprod. — 1999. — Vol. 19 — № 4. — P. 382—389.

Об авторах / Для корреспонденции

Лебедева Ольга Евгеньевна, аспирант отд-ния вспомогательных технологий в лечении бесплодия ФГУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздравсоцразвития РФ
Адрес: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4
Тел: 438-25-01
E-mail:ncagp@bk.ru

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь