Роль «поздних» белков вируса папилломы человека L1 и L2 в дифференциальной диагностике плоскоклеточных интраэпителиальных поражений

Цель: Оценить и провести анализ экспрессии белков вируса папилломы человека (ВПЧ) L1 и L2 иммуногистохимическим (ИГХ) и L1 иммуноцитохимическим (ИЦХ) методами для дифференциальной диагностики плоскоклеточных интраэпителиальных поражений шейки матки.
Материалы и методы: В поперечное (cross-sectional study) исследование включены 128 пациенток, обратившихся в научно-поликлиническое отделение ФГБУ «НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова» МЗ РФ в период с января 2022 г. по январь 2023 г., с учетом критериев включения и исключения. В зависимости от результатов цитологического исследования шейки матки все обследуемые пациентки были разделены на 4 группы: группа 1 – 36 женщин с цитологическим заключением «NILM»; группа 2 – 31 пациентка с цитологическим заключением «ASC-US»; группа 3 – 31 пациентка с цитологическим заключением «LSIL», группа 4 – 30 пациенток с цитологическим заключением «HSIL». Всем пациенткам было проведено цитологическое, кольпоскопическое и гистологическое исследования, а также ИЦХ- и ИГХ-исследования для определения уровня экспрессии вирусных белков ВПЧ L1 и L1/L2 соответственно.
Результаты: В результате статистически значимо чаще наблюдалась выраженная экспрессия L1 ВПЧ ИЦХ-методом в группе LSIL (65,6%) в сравнении с HSIL (20%) и NILM (19,4%) (χ2 Пирсона, р<0,001). Вероятность выявления LSIL по результатам цитологического исследования среди всех образцов, положительных на L1, в 2,1 раза выше по сравнению с образцами, отрицательными на L1 (95% ДИ 1,98–10,87, р<0,001). Применение ИГХ-метода позволило выявить экспрессию вирусного белка L1 в 72,9% случаев LSIL (CIN1), что было статистически значимо чаще, чем в других исследуемых группах (р<0,001). В группе гистологически верифицированного LSIL (CIN1) наблюдалась позитивная экспрессии белка ВПЧ L2 в 48,8% случаев. 
Заключение: Результаты исследования убедительно демонстрируют, что использование «поздних» белков ВПЧ L1 и L2 позволит в значительной степени улучшить дифференциальную диагностику плоскоклеточных интраэпителиальных поражений легкой степени. 

Вклад авторов: Добровольская Д.А., Байрамова Г.Р., Асатурова А.В. – разработка дизайна исследования, обзор публикаций по изучаемой проблеме, их перевод, статистический анализ полученных данных, написание текста рукописи; Добровольская Д.А., Бадлаева А.С., Трегубова А.В. – получение данных для анализа; Асатурова А.В., Байрамова Г.Р. – структурирование и редaктирование статьи.
Конфликт интересов: Авторы заявляют об отсутствии конфликтов интересов.
Финансирование: Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Москвы в рамках научного проекта № 21-315-70048. Договор № 21-315-70048 «Изучение роли вирусных репликативных белков раннего ответа вируса папилломы человека в модуляции сигнальных путей эпителиоцитов шейки матки при начальных формах интраэпителиальных плоскоклеточных поражений шейки матки с применением методов нейросетевого анализа».
Одобрение Этического комитета: Исследование было одобрено локальным Этическим комитетом ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ.
Согласие пациентов на публикацию: Пациентки подписали информированное согласие на публикацию своих данных.
Обмен исследовательскими данными: Данные, подтверждающие выводы этого исследования, доступны по запросу у автора, ответственного за переписку, после одобрения ведущим исследователем.
Для цитирования: Добровольская Д.А., Байрамова Г.Р., Асатурова А.В., Бадлаева А.С., Трегубова А.В. Роль «поздних» белков вируса папилломы человека L1 и L2 в дифференциальной диагностике плоскоклеточных интраэпителиальных поражений.
Акушерство и гинекология. 2025; 2: 81-90
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2024.298

Существуют неопровержимые доказательства того, что высокоонкогенные типы вируса папилломы человека (ВПЧ) являются основными причинными факторами развития плоскоклеточных интра­эпителиальных поражений (squamous intraepithelial lesion, SIL) и рака шейки матки (РШМ). Известно, что одного ВПЧ недостаточно для индукции злокачественной трансформации плоскоклеточных интраэпителиальных поражений легкой степени, а оценка прогрессии SIL, связанная с разными типами ВПЧ, дискутабельна. На сегодняшний день чрезвычайно актуальным является поиск биомаркеров, которые позволят отличить «пул» пациенток с цитологически подтвержденным LSIL (squamous intraepithelial lesion low-grade/плоскоклеточные интраэпителиальные поражения низкой степени), вызванным транзиторной ВПЧ-инфекцией с возможностью самоэлиминации вируса, от поражений, связанных с интеграцией вирусной ДНК в геном клеток хозяина c высоким потенциалом к прогрессированию [1, 2]. По данным литературы, диагностическая точность цитологического исследования для LSIL составляет 79,4%, в то время как для плоскоклеточных интраэпителиальных поражений высокой степени (squamous intraepithelial lesion high-grade, HSIL) – 100% [3, 4]. В этой связи разрабатываются новые подходы для оптимизации дифференциальной диагностики SIL с позиции биологии ВПЧ с целью повышения качества оказания медицинской помощи [5, 6].

Цель исследования: оценить и провести сравнительный анализ экспрессии белков ВПЧ L1/L2 иммуногистохимическим (ИГХ) и L1 иммуноцитохимическим (ИЦХ) методами для дифференциальной диагностики SIL.

Материалы и методы

В поперечное исследование (cross-sectional study) были включены 128 пациенток, обратившихся в научно-поликлиническое отделение ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» МЗ РФ в период с января 2021 г. по декабрь 2022 г. Пациентки были разделены на 4 группы: группа 1 (контрольная) – женщины с NILM (negative for intraepithelial lesion or malignancy/негативные в отношении интраэпителиальных поражений или малигнизации) (n=36); группа 2 – женщины с ASC-US (atypical squamous cells of undetermined significance/клетки плоского эпителия с атипией неясного генеза) (n=31); группа 3 – женщины с LSIL (n=31); группа 4 – женщины с HSIL (n=30). Критерии включения в исследование: возраст от 18 до 45 лет и позитивный ВПЧ-статус женщины. Критерии невключения: беременность, период грудного вскармливания, наличие психоневрологических заболеваний (отсутствие возможности следовать протоколу) и обострение онкологических заболеваний. Все пациентки, включенные в исследование, подписали информированное добровольное согласие и им были проведены цитологическое (жидкостная цитология), кольпоскопическое и гистологическое исследования, а также ИЦХ- и ИГХ-исследования для определения уровня экспрессии белков ВПЧ L1 и L1/L2 соответственно.

Для выполнения иммуногистохимического исследования с парафиновых блоков были изготовлены срезы толщиной 4–5 мкм, которые затем были нанесены на предметные стекла с положительным зарядом поверхности SuperFrost Plus (Thermo Scientific) и высушены в термостате в течение 24 ч при температуре 48°С. Стекла были окрашены при помощи иммуностейнера BenchMark XT (Ventana, Roche, Швейцария) с использованием стандартных протоколов, панели детекции DAB Universal ultraView (Ventana, Roche, Швейцария). Используемые антитела: HPV16 L1 (Biorbyt), клон MCAPL1, хозяин мышь, разведение 1:250; HPV16 L2 (Biorbyt), поликлональное, хозяин кролик, разведение 1:250. Для приготовления микропрепаратов для ИЦХ-исследования биоматериал центрифугировался в пробирке в течение 2 минут, скорость – 200 оборотов в минуту. Затем в пробирку добавляли BD Density Reagent, дважды центрифугировали в течение 10 минут с последующим удалением надосадочной жидкости. Полученный осадок в объеме 100 мкл наносили на стекло BD SurePath PreCoat Slides, добавляли 200 мкл реакционного буфера и инкубировали 40 минут при комнатной температуре. Далее добавляли 500 мкл BD Alcohol Blend Rinse и инкубировали 5 минут. Затем полученные микропрепараты были высушены в термостате в течение часа при температуре 37°С.

ИЦХ-исследование выполнялось при помощи иммуностейнера BenchMark XT с использованием стандартных протоколов, с использованием RTU антитела к Cytoactive L1 (Cytoimmun Diagnostics, Германия).

Положительным результатом считалось наличие экспрессии белка L1 или L2 в более чем 10% клеток. Оценка распределения белков L1 и L2 производилась полуколичественным методом, где 0 баллов – отсутствие, 1 – слабые, 2 – умеренные и 3 балла – выраженные изменения. Оценка выявления белка L1 ИЦХ-методом производилась бикатегориальным методом с учетом его распределения в эпителиальном пласте.

Статистический анализ

Размер выборки был рассчитан на основании ожидаемой чувствительности и специфичности индексных тестов. Для достижения мощности 80% и уровня значимости 0,05 потребовалось включение 128 пациенток.

Статистический анализ полученных данных проводился с использованием стандартных методов мат...

Добровольская Д.А., Байрамова Г.Р., Асатурова А.В., Бадлаева А.С., Трегубова А.В.