Синдром задержки роста плода и маркеры митохондриальной дисфункции

DOI: https://dx.doi.org/10.18565/aig.2018.6.31-36

02.07.2018
404

ФГБУ Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, Москва

Цель исследования. Провести сравнительный анализ содержания компонентов митохондрий в плаценте и цельной крови женщин при физиологическом течении беременности и беременности, осложненной синдромом задержки роста плода.
Материал и методы. Обследованы 32 женщины (10 пациенток с физиологической беременностью и 12 – с диагностированным синдромом задержки роста плода) в сроки начиная с 24 недель гестации. Определено содержание белков OPA1, DRP1, VDAC1, TFAM, hOGG1 методом Вестерн-блот анализа с детекцией хемилюминесценции. Уровень копийности митохондриальной ДНК в крови определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени.
Результаты. Было обнаружено повышение содержания белка hOGG1 без изменения уровня факторов слияния и фрагментации митохондрий в ткани плаценты изучаемых групп. Было показано достоверное снижение уровня копийности митохондриальной ДНК на сроках 25, 29 и 37 недель беременности в крови пациенток с синдромом задержки роста плода по сравнению с аналогичными сроками при физиологическом течении беременности.
Заключение. При беременности, осложненной синдромом задержки роста плода, наблюдаются выраженные проявления окислительного стресса. Снижение копийности митохондриальной ДНК в крови матери при синдроме задержки роста плода может свидетельствовать о выраженной митохондриальной дисфункции в плаценте и использоваться как прогностической маркер данной патологии.

Синдром задержки роста плода (СЗРП) – патологическое состояние, связанное с отставанием размеров плода от предполагаемых для данного срока гестации и массой плода при рождении ниже десятого процентиля для данного срока беременности. СЗРП может приводить к целому спектру перинатальных осложнений, включая внутриутробную асфиксию и гибель плода. Около 60% неонатальных смертей, которые происходят во всем мире каждый год, связаны с низким весом при рождении [1, 2]. Задержка роста плода происходит в результате недостаточного поступления кислорода и нутриентов, в том числе по причине изменений сосудов фето-плацентарного комплекса. Известно, что у пациенток с последующим развитием СЗРП уже в первом триместре беременности происходит нарушение инвазии трофобласта, вследствие чего развиваются гемодинамические нарушения маточно-плацентарного кровотока, приводящее к хронической гипоксии [3]. Патологические изменения кровотока в спиральных артериях и межворсинчатом пространстве приводит к снижению интенсивности газообмена между матерью и плодом. Эндогенная антиоксидантная система при критических уровнях гипоксии оказывается несостоятельной, что приводит к развитию выраженного окислительного стресса [4–6].

Окислительный стресс является закономерным явлением во время беременности, как при нормальном ее течении, так и при патологии [4]. Физиологическая беременность сопровождается увеличением метаболической активности организма и потребности тканей в кислороде, что приводит к окислительному стрессу как следствию интенсификации работы митохондриального аппарата и усиленного клеточного дыхания [7]. Параллельно с этим происходит компенсаторное повышение активности антиоксидантной системы. Митохондриальные дисфункции различного генеза приводят к неконтролируемому окислительному стрессу на клеточном и тканевом уровнях и к развитию осложнений беременности, в том числе и СЗРП [4, 8].

Митохондрии являются основными источниками активных форм кислорода (АФК) в клетке, при этом сами наиболее подвержены их разрушительному влиянию: окислению липидов, белков, нуклеиновых кислот [7]. Во время беременности повреждение клеток свободными радикалами не только приводит к разрушению мембран и нарушениям структуры клеток и тканей, но и способно запускать реакции запрограммированной гибели клеток – апоптоз. При манифестации массовой гибели клеток синцитиотрофобласта в системный кровоток матери, помимо мембранных фрагментов, в значительном количестве попадают компоненты внутриклеточных органелл, в том числе митохондриальная ДНК (мтДНК). В связи с этим определение количества копий мтДНК в крови матери представляет большой интерес в качестве возможного маркера развития осложнений гестации.

Известно, что процессы митохондриального биогенеза и селекции дефектных митохондрий тесно взаимосвязаны и регулируются как внешними, так и внутренними факторами. Поврежденные митохондрии селективно удаляются из клетки путем митофагии. Баланс между скоростью биогенеза и митофагии определяет количество митохондрий в клетке, а следовательно, и ее метаболический статус.

Изучение митохондриального биогенеза, процессов митохондриального слияния и фрагментации, а также митофагии является важным этапом в понимании причинно-следственных связей гестационных осложнений при СЗРП и участия в них митохондрий.

В связи с вышесказанным целью исследования было оценить экспрессию основных маркеров слияния и фрагментации митохондрий в ткани плаценты, а также определить число копий мтДНК в крови женщин при физиологическом течении беременности и с диагностированным СЗРП.

Материал и методы исследования

На первом этапе в исследование были включены 27 женщин, родоразрешенных путем плановой операции кесарева сечения и была создана коллекция образцов ткани плаценты. Все пациентки были разделены на две группы: в основную группу вошли беременные женщины с диагностированным СЗРП; контрольную группу составили женщины с физиологическим течением беременности (ФБ) и неотягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом. Все обследованные женщины подписали информированное согласие на участие в исследовании.

Для выполнения второго этапа была сформирована коллекция образцов цельной крови, полученной в разные сроки гестации у пациенток с диагностированным СЗРП и ФБ (контроль). В группе ФБ было проанализировано 10 женщин / 30 образцов крови, в группе СЗРП – 12 женщин / 33 образца крови.

Критериями включения в исследование являлись: возраст от 18 до 45 лет; одноплодная беременность с гестационным сроком от 24 до 40 недель, наступившая самопроизвольно; родоразрешение путем операции кесарева сечения. Критериями исключения являлись тяжелая экстрагенитальная патология, включая сахарный диабет, заболевания почек и сердечно-сосудистой системы, инфекционные заболевания.

В работе проводили общеклиническое и лабораторное обследование женщин. В качестве специальных методов исследования были использованы гель-электрофорез, Вестерн-блот анализ с детекцией хемилюминесценции и полимеразная цепная реакция в реальном времени (ПЦР-РВ). Оценивали содержание белков OPA, DRP, VDAC1, TFAM, hOGG1 и уровень экспрессии гена OPA1 в тканях плаценты. В образцах цельной крови был проведен количественный анализ копийности мтДНК методом ПЦР-РВ. Количество ПЦР-продукта целевого гена – участка D-петли мтДНК (mtDNA D-loop), нормировали на количество ПЦР-продукта ядерного гена – β2-микроглобулина.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью программы GraphPad Prism. Выборки проверяли на нормальность распределения тестов Шапиро–Уилка. В случае нормально распределенных данных использовали параметрические методы оценки (ANOVA, t-тест Стьюдента), в обратном случае – непараметрические методы (критерий Краскела–Уоллиса, тест Манна–Уитни).

Результаты исследования

На первом этапе работы оценивали экспрессию основных факторов слияния (OPA1) и фрагментации (DRP1) митохондрий, а также структурно-функциональных белков VDAC1 и TFAM и белка системы репарации мтДНК (hOGG1) в образцах ткани плаценты. Клинические и демографические данные пациенток, вошедших в это исследование, представлены в таблице. В группе СЗРП наблюдали значимые различия с контролем по следующим параметрам: срок гестации (ФБ – 39,0±0,9 недель; СЗРП – 34,7±3,1 недель, * – р<0,05), масса тела новорожденного (ФБ – 3396,5±471,8 г; СЗРП – 1948,3±513,7 г, * – р<0,05) и длина тела новорожденного (ФБ – 51,2±2,3 см; СЗРП – 43,6±5,6 см, * – р<0,05).

ПЦР-анализ не выявил достоверных различий в уровне относительной экспрессии гена OPA1 в исследованных группах (рис. 1А). С этим результатом хорошо согласуются данные, полученные методом Вестерн-блот анализа – уровень обеих форм OPA1 (1-я полоса соответствует нерасщепленному белку, 2-я полоса – расщепленному белку; рис. 1Б) в группе с СЗРП также не изменялся по сравнению с ФБ (рис. 1В).

Анализ уровня белка DRP1 – важного фактора фрагментации митохондрий также не выявил статистически значимых различий между двумя группами (рис. 1Г). Таким образом, можно сделать вывод, что, по-видимому, при СЗРП в плаценте основные механизмы слияния и фрагментации митохондрий не затронуты.

Содержание структурно-функционального белка внешней мембраны митохондрий – VDAC1 и активатора транскрипции и репликации мтДНК – белка TFAM, статистически значимо не различалось между группами (рис. 2А, Б). При этом уровень белка hOGG1 – фермента, ответственного за удаление окисленного гуанина при повреждении мтДНК в группе СЗРП оказался значимо выше, чем при ФБ (р<0,05, рис. 2В), что свидетельствует об активации системы репарации мтДНК.

Повышение содержания белка hOGG1 диктует необходимость исследовать копийность мтДНК, являющуюся важным маркером митохондриального биогенеза. В связи с этим на втором этапе работы мы оценивали этот показатель в цельной крови женщин исследуемых групп ФБ и СЗРП.

Применение одностороннего дисперсионного анализа Крaскела–Уоллиса не выявило достоверного влияния срока гестации на количество копий мтДНК в группе ФБ (рис. 3А), тогда как в группе СЗРП данный фактор оказывал значимое (p=0,02) влияние на копийность мтДНК в крови. Применение пост-теста критерия Данна для последующего множественного сравнения показало значимое увеличение содержания мтДНК на 29-й, 33-й и 37-й неделе по сравнению с 25-й неделей гестации в группе женщин с СЗРП (рис. 3Б). Таким образом, можно заключить, что копийность мтДНК не изменяется по мере прогрессирования беременности у женщин с неотягощенным акушерско-гинекологическим анамнезом, в то время как у пациенток с СЗРП наблюдается увеличение количества копий мтДНК в крови, начиная с 29-й недели гестации с достижением максимума на сроке 33-й недели.

Попарный анализ групп на разных сроках гестации с помощью критерия Манна–Уитни выявил, что на разных сроках гестации копийность мтДНК была достоверно ниже в группе СЗРП по сравнению с контролем (25 недель p=0,01; 29 недель p=0,04; 37 недель p=0,01; рис. 4).

Заключение

Полученные данные свидетельствуют, что при СЗРП в плаценте не происходят изменения в содержании белков, отвечающих за слияние и фрагментацию митохондрий. Однако мы обнаружили значимое повышение экспрессии фермента системы репарации мтДНК – hOGG1 в группе СЗРП по сравнению с контролем. Повышение экспрессии hOGG1 в группе СЗРП указывает на развитие окислительного стресса, усиление репарации поврежденной мтДНК, копийность которой достигает своего максимума на 33-й неделе беременности в этой группе.

Уровень мтДНК положительно коррелирует с количеством и размером митохондрий [9] и регулируется эндогенными и экзогенными факторами, такими как гипоксемия и стероидные гормоны [10]. Определение относительного уровня копийности мтДНК служит классическим тестом для анализа содержания митохондрий. Как правило, мтДНК располагается вблизи внутренней мембраны митохондрии и, в отличие от ядерной, не защищена гистонами, поэтому постоянно подвергается воздействию свободных радикалов, образуемых дыхательной цепью митохондрий [11, 12]. Поэтому мтДНК особенно чувствительна к повреждениям, вызванным окислительным стрессом.

Копийность мтДНК рассматривается в литературе как новый маркер системной митохондриальной дисфункции, поскольку отражает количество и качество митохондрий. Ранее было показано, что в крови женщин увеличение копийности мтДНК положительно коррелировало с вероятностью отслойки плаценты [13]. В нашей работе было выявлено, что у женщин с диагнозом СЗРП количество мтДНК в крови ниже практически на всех сроках беременности по сравнению с женщинами с нормально протекающей беременностью в те же сроки. Это может свидетельствовать о наличии системной митохондриальной дисфункции у пациенток с СЗРП, которая может служить одной из причин возникновения плацентарной недостаточности. С другой стороны, также отмечается положительная динамика роста количества мтДНК в крови матерей с СЗРП после 25-й недели беременности, сохраняющаяся вплоть до родов, что может свидетельствовать о запуске адаптивного ответа организма.

Дальнейшие исследования в данной области позволят разработать подходы к ранней диагностике СЗРП и прогнозированию исходов беременности при плацентарной недостаточности на базе анализа уровня мтДНК в крови.

Список литературы

1. Romo A., Carceller R., Tobajas J. Intrauterine growth retardation (IUGR): epidemiology and etiology. Pediatr. Endocrinol. Rev. 2009; 6(Suppl. 3):332-6.

2. Lawn J.E., Cousens S., Zupan J.; Lancet Neonatal Survival Steering Team. 4 million neonatal deaths: When? Where? Why? Lancet. 2005; 365(9462):891-900.

3. Kaufmann P., Black S., Huppertz B. Endovascular trophoblast invasion: implications for the pathogenesis of intrauterine growth retardation and preeclampsia. Biol. Reprod. 2003; 69(1): 1-7.

4. Duhig K., Chappell L.C., Shennan A.H. Oxidative stress in pregnancy and reproduction. Obstet. Med. 2016; 9(3): 113-6.

5. Biri A., Bozkurt N., Turp A., Kavutcu M., Himmetoglu Ö., Durak I. Role of oxidative stress in intrauterine growth restriction. Gynecol. Obstet. Invest. 2007; 64(4): 187-92.

6. Karacay Ö., Sepici-Dincel A., Karcaaltincaba D., Sahin D., Yalvaç S., Akyol M. et al. A quantitative evaluation of total antioxidant status and oxidative stress markers in preeclampsia and gestational diabetic patients in 24-36 weeks of gestation. Diabetes Res. Clin. Pract. 2010;89(3): 231-8.

7. Korshunov S.S., Skulachev V.P., Starkov A.A. High protonic potential actuates a mechanism of production of reactive oxygen species in mitochondria. FEBS Lett. 1997; 416(1): 15-8.

8. Мартусевич А.К., Карузин К.А. Окислительный стресс и его роль в формировании дизадаптации и патологии. Биорадикалы и антиоксиданты. 2015; 2(2): 5-18.

9. Lee H.C., Wei Y.H. Mitochondrial biogenesis and mitochondrial DNA maintenance of mammalian cells under oxidative stress. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2005; 37(4): 822-34.

10. Shadel G.S. Expression and maintenance of mitochondrial DNA: new insights into human disease pathology. Am. J. Pathol. 2008;172(6): 1445-56.

11. Tan D., Goerlitz D.S., Dumitrescu R.G., Han D., Seillier-Moiseiwitsch F., Spernak S.M. et al. Associations between cigarette smoking and mitochondrial DNA abnormalities in buccal cells. Carcinogenesis. 2008; 29(6): 1170-7.

12. Holland O., Nitert M.D., Gallo L.A., Vejzovic M., Fisher J.J., Perkins A.V. Placental mitochondrial function and structure in gestational disorders. Placenta. 2017; 54: 2-9.

13. Williams M.A., Sanchez S.E., Ananth C.V., Hevner K., Qiu C., Enquobahrie D.A. Maternal blood mitochondrial DNA copy number and placental abruption risk : results from a preliminary study. Int. J. Mol. Epidemiol. Genet. 2013; 4(2): 120-7.

Поступила 06.04.2018

Принята в печать 20.04.2018

Об авторах / Для корреспонденции

Вишнякова Полина Александровна, к.б.н., научный сотрудник лаборатории митохондриальной медицины ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. E-mail: p_vishnyakova@oparina4.ru
Суханова Юлия Алексеевна, младший научный сотрудник лаборатории митохондриальной медицины ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. E-mail: suhanova_julia@hotmail.com
Микаелян Асмик Гагиковна, аспирант, 2-е отделение акушерское патологии беременности ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-14-77. E-mail: mikaelyan_asmik@bk.ru
Булатова Юлия Сергеевна, аспирант, 2-е отделение акушерское патологии беременности ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-14-77. E-mail: yu.bulatova@mail.ru
Пятаева Софья Владимировна, к.б.н., научный сотрудник лаборатории митохондриальной медицины ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. E-mail: biosonya@gmail.com
Балашов Иван Сергеевич, специалист лаборатории биоинформатики ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (910) 446-20-05. E-mail: i_balashov@oparina4.ru
Боровиков Павел Игоревич, зав. лабораторией биоинформатики ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (919) 109-12-64. E-mail: p_borovikov@oparina4.ru
Тетруашвили Нана Картлосовна, д.м.н., зав. отделением, 2-е отделение акушерское патологии беременности ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-14-77. E-mail: tetrauly@mail.ru.
Высоких Михаил Юрьевич, к.б.н., зав. лабораторией митохондриальной медицины ФГБУ НМИЦ АГП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России.
Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. E-mail: m_vysokikh@oparina4.ru

Для цитирования: Вишнякова П.А., Суханова Ю.А., Микаелян А.Г., Булатова Ю.С., Пятаева С.В., Балашов И.С., Боровиков П.И., Тетруашвили Н.К., Высоких М.Ю. Синдром задержки роста плода и маркеры митохондриальной дисфункции. Акушерство и гинекология. 2018; 6: 31-6.
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2018.6.31-36

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь