Акушерство и Гинекология №8 / 2021
Состояние иммунной системы у пациентов с различной степенью тяжести COVID-19
ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва, Россия
Цель. Оценка состояния иммунной системы и сравнение иммунологических показателей у пациентов с разной тяжестью течения COVID-19.
Материалы и методы. В проспективное исследование были включены 62 больных COVID-19. В зависимости от тяжести заболевания пациенты были разделены на 3 группы: группа 1 – 29 человек с легкой формой болезни; группа 2 – 17 человек со среднетяжелой формой COVID-19; группа 3 – 16 человек с тяжелой формой болезни. На 3–7-е сутки от начала заболевания проводили фенотипирование лимфоцитов периферической крови методом проточной цитометрии и определение концентрации цитокинов мультиплексным методом с использованием стандартной 48-плексной тест-системы Bio-Plex Pro™ Human Cytokine Screening (Bio-Rad, США) на проточном лазерном иммуноанализаторе Bio-Plex 200.
Результаты. Было выявлено, что пациенты с тяжелой формой COVID-19 имели более высокий уровень лейкоцитов, нейтрофилов и С-реактивного белка (СРБ), а также низкий уровень относительного и абсолютного содержания лимфоцитов. Из показателей иммунограммы выявлено низкое содержание абсолютного количества CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, Т-лимфоцитов, экспрессирующих активационный маркер HLA-DR (CD3+HLA-DR+), NK-клеток, а также фагоцитарной активности нейтрофилов; к тому же отмечено изменение 39 из 48 исcледованных растворимых факторов в третьей группе.
Заключение. Высокие уровни лейкоцитов, нейтрофилов, СРБ, нейтрофильно-лейкоцитарного индекса, а также низкий уровень относительного и абсолютного содержания лимфоцитов, выраженные изменения иммунологических показателей, системная воспалительная реакция, связанная с высвобождением медиаторов, называемых цитокинами («цитокиновый шторм»), предрасполагают к тяжелой форме течения COVID-19.
В декабре 2019 г. в Ухане (Китай) произошла вспышка заболевания (COVID-19), вызванного новой коронавирусной инфекцией (SARS-CoV-2), которая быстро распространилась по всему миру.
К настоящему времени накопилось достаточно данных, свидетельствующих о том, что заболевание, вызванное SARS-CoV-2, протекает в различных формах – от бессимптомного течения до тяжелых форм, сопровождающихся обширным поражением легких, приводящим к острому респираторному дистресс-синдрому, полиорганной недостаточности и сепсису [1, 2]. Уровень смертности составляет 0,5–3,5% [3].
Значимую роль в развитии тяжелых форм заболевания играет нарушение регуляции иммунного ответа, поэтому раннее выявление маркеров иммунной дисрегуляции может помочь в понимании патогенеза развития тяжелых форм заболевания и разработке методов терапии и профилактики данных осложнений.
Целью исследования было оценить состояние иммунной системы и сравнить различия в иммунологических показателях у пациентов с разной тяжестью течения COVID-19.
Материалы и методы
В проспективное исследование были включены 62 больных COVID-19. Критериями включения явились: подтверждение диагноза COVID-19, возраст 18+ лет, подписанное информированное добровольное согласие на включение в исследование и возможность проведения забора крови через 3–7 дней от старта заболевания. Критериями исключения были: ВИЧ-инфекция и другие врожденные и приобретенные иммунодефициты, любые хронические инфекционные, онкологические, аутоиммунные и ревматические заболевания, период беременности и лактации для женщин, прием иммуномодулирующих препаратов в течение не менее 3 месяцев до старта болезни и во время болезни.
В зависимости от тяжести заболевания пациенты были разделены на 3 группы: группа 1 – 29 человек с легкой формой болезни; группа 2 – 17 человек со среднетяжелой формой COVID-19; группа 3 – 16 человек с тяжелой формой болезни.
Критериями легкой формы COVID-19 было выявление РНК SARS-CoV-2 методом полимеразной цепной реакции с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) в мазке из ротоглотки в сочетании со следующими клиническими проявлениями: температура не выше субфебрильной (<38°С) и отсутствие критериев тяжелого и среднетяжелого течения инфекции.
Критериями среднетяжелой формы заболевания было выявление РНК SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР в мазке из ротоглотки в сочетании с каким-либо из следующих клинических проявлений: температура выше субфебрильной (>38°С), частота дыхательных движений (ЧДД) >22/мин, одышка при физических нагрузках, сатурация кислорода (SpO2) <95%; наличие пневмонии по данным компьютерной томографии (КТ) с минимальным или средним объемом поражения легких (КТ 1–2).
Критериями тяжелой формы заболевания было выявление РНК SARS-CoV-2 методом ОТ-ПЦР в мазке из ротоглотки в сочетании с каким-либо из следующих клинических проявлений: ЧДД > 30/мин;
SpO2 ≤93%; PaO2/FiO2 ≤300 мм рт.ст.; снижение уровня сознания, ажитация; нестабильная гемодинамика (систолическое АД менее 90 мм рт.ст. или диастолическое АД менее 60 мм рт.ст., диурез менее 20 мл/ч); изменения в легких при КТ (рентгенографии), типичные для вирусного поражения (объем поражения значительный или субтотальный; КТ 3–4); qSOFA >2 баллов [4].
Идентификация вируса проводилась с помощью «Набора реагентов для выявления РНК коронавирусов SARS-CoV-2 и подобных SARS-CoV методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (SARS-CoV-2/SARS-CoV)» (ООО НПО «ДНК-Технология», Россия). В качестве мишеней были выбраны три участка генома: специфичные для коронавируса ЅАRЅ-СоV-2 участки гена N и гена Е, а также консервативный участок гена Е, общий для группы коронавирусов, подобных ЅАRЅ-СоV (включая ЅАRЅ-СоV и ЅАRЅ-СоV-2). Амплификацию проводили на приборе «ДТ-964» (ООО НПО «ДНК-Технология», Россия). Обработка результатов осуществлялась автоматически с помощью программного обеспечения к прибору.
На 3–7-е сутки от начала заболевания производились забор крови из периферической вены и оценка параметров иммунограммы с оценкой общего числа лимфоцитов, анализом субпопуляционного состава лимфоцитов: CD3+, CD3+CD4+, CD3+CD8+, CD19+, CD3-CD56+CD16+, CD3+CD56+CD16+, CD19+CD5+, Tрег, с оценкой содержания в периферической крови активированных лимфоцитов (CD3+HLA-DR+, CD3+CD25+), а также фагоцитарной активности нейтрофилов (ФАН) с расчетом индекса стимуляции (ИС).
Фенотипирование лимфоцитов периферической крови осуществлялось методом проточной цитометрии с помощью моноклональных антител (мАт), меченных FITC или PE, против антигенов CD3 (FITC), CD4 (PE), CD5 (PE), CD8 (PE), CD16 (PE), CD19 (FITC), CD56 (PE), CD25 (FITC), HLA-DR (FITC) (Becton Dickinson и eBioscience, США). Оценивалось содержание основных субпопуляций иммунокомпетентных T-клеток (СD3+, CD4+, CD8+), В-клеток (CD19+), B1-клеток (CD19+CD5+), NK-клеток (СD56+СD16+). Лимфоцитарный гейт, позволяющий исключить из анализа другие клетки крови, выявлялся с помощью мАт к СD45, меченных перидинин-хлорофилл-протеином (PerCP), (Dako, Дания). Для оценки позитивноокрашенных субпопуляций использовались соответствующие FITC- или PE-меченые изотипические IgG.
Трег-клетки с внутриклеточной экспрессией FOXP3 в цельной крови определялись как субпопуляция с фенотипом СD4+CD25highCD127low/-, с использованием сочетания мАт к антигенам CD4, меченных PerCP (eBioscience, США), CD25, меченных FITC (Becton Dickinson, США), и СD127, меченных РЕ (eBio...
95%;>38°С)>
