Современные возможности молекулярно-генетических методов в диагностике раннего неонатального сепсиса у недоношенных новорожденных

Цель исследования. Поиск ранних диагностических биомаркеров раннего неонатального сепсиса (РНС) у недоношенных новорожденных с использованием молекулярно-генетических методов.
Материал и методы. Исследованы клетки буккального соскоба (БС) и венозная кровь (ВК) 71 недоношенного ребенка, находившихся на лечении в отделении реанимации и интенсивной терапии новорожденных (ОРИТН) ФГБУ НЦАГиП им. В.И. Кулакова в период с 08.2012 г. по 03.2015 г.
Результаты. В ходе проведенного исследования показано, что течение РНС у недоношенных детей сопровождается общим состоянием иммуносупрессии. Выявлено изменение экспрессии генов IL12A в клетках БС и TNFA и GATA3 в ВК.
Заключение. С помощью современных молекулярно-генетических методов определены кандидатные диагностические биомаркеры РНС у недоношенных новорожденных. Создана математическая модель, позволяющая диагностировать РНС на основании определения уровня экспрессии генов IL12A и CD68 в клетках БС недоношенных новорожденных с чувствительностью 81% и специфичностью 74%. Предлагаемая к использованию методика носит неинвазивный характер, способна ускорить диагностический поиск и оптимизировать сроки начала патогенетической терапии РНС у недоношенных детей в условиях ОРИТН.

Частота рождения недоношенных детей в последнее десятилетие не имеет тенденции к снижению. Данный показатель вариабелен и в большинстве развитых стран Европы находится в диапазоне от 5 до 10%, в Китае – 6%, в различных регионах России составляет от 4 до 16% [1, 2]. Сепсис и тяжелые инфекции остаются одной из актуальных проблем современной неонатологии, несмотря на улучшение показателей выживаемости глубоко недоношенных детей. Клинические проявления раннего неонатального сепсиса (РНС) развиваются у новорожденных в первые трое суток. Основными микроорганизмами, вызывающими РНС у доношенных детей, являются Escherichia coli, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus aureus, Listeria spp. [3, 4]. Критерии клинической диагностики РНС у доношенных новорожденных в настоящее время хорошо известны и стандартизованы. У недоношенных детей, родившихся до завершения 34 недели беременности, спектр возбудителей, вызывающих РНС, несколько иной, чем у доношенных новорожденных. Наиболее частыми возбудителями РНС у глубоко недоношенных детей являются Ureaplasma spp., Mycoplasma spp., Fusobacterium spp. Streptococcus spp., Bacteroides spp. и Prevotella spp. [5, 6].

Следует также отметить, что истинная частота РНС, вызванного анаэробными микроорганизмами, в настоящее время неизвестна.

В силу неполноценности механизмов врожденного иммунитета бактериальные инфекции у глубоко недоношенных детей имеют склонность к быстрой генерализации и тяжелому течению. Клиническая картина инфекционных заболеваний часто маскируется другими патологическими состояниями. Частой причиной возникновения угрожающих жизни осложнений при РНС у таких детей является отсроченная постановка диагноза и, как следствие, позднее начало целенаправленной терапии [7].

Ранняя диагностика септического процесса у недоношенных новорожденных сложна ввиду неспецифического характера клинических симптомов, отсутствия надежных диагностических критериев и высокочувствительных биомаркеров. Основными методами обследования новорожденных детей при подозрении на РНС в настоящее время являются микробиологические (посев крови на стерильность), клинико-лабораторные (клинический анализ крови с определением количества лейкоцитов и нейтрофилов в периферической крови, подсчет нейтрофильного индекса, определение белков острой фазы воспаления) и инструментальные (рентгенологическое исследование органов грудной полости) [8].

Традиционная диагностика путем анализа гемокультуры имеет низкую чувствительность и требует длительного времени для проведения исследования. Частота обнаружения возбудителя в крови у больных с сепсисом по данным различных авторов не превышает 45%, а отсутствие бактериемии не исключает развития РНС при наличии основных критериев этого заболевания [9, 10]. В случае выявления возбудителя РНС, как правило, требуется не менее 48 часов для идентификации вида и определения чувствительности к антибиотикам. При этом многие анаэробные бактерии относятся к некультивируемым формам, то есть не растут на питательных средах и могут быть идентифицированы в биологических жидкостях лишь благодаря применению молекулярно-генетических методов. Однако, учитывая крайне незначительное количество возбудителя в кровотоке, прямое определение микроорганизмов в крови сопряжено со значительными технологическими трудностями и не обладает достаточной чувствительностью для ранней диагностики.

Количество лейкоцитов в периферической крови у глубоко недоношенных детей, так же как и у доношенных, зависит от времени взятия образца крови после рождения и имеет ограниченное значение в постановке диагноза РНC. Нейтрофильный индекс (отношение незрелых форм нейтрофилов к их общему количеству) в большей степени позволяет исключить, нежели подтвердить наличие инфекционного процесса в периоде новорожденности [7]. Анализ белков острой фазы воспаления в сыворотке крови при РНС также не всегда является информативным. Выявляемые нередко рентгенологические изменения в виде снижения пневматизации легочной ткани и усиления бронхо-сосудистого рисунка у недоношенных детей не являются специфичными для РНС [3, 10].

Значительным потенциалом в отношении быстрой диагностики РНС, понимания патогенеза, оценки эффективности проводимого лечения и прогнозирования исходов могут обладать молекулярные биомаркеры. Идеальный биомаркер должен быть элементом патогенеза РНС, обладать достаточной чувствительностью и специфичностью. Современные биомаркеры могут быть использованы не только как индикаторы наличия/отсутствия сепсиса, но и для дифференциальной диагностики бактериальной, грибковой и вирусной инфекции, а также для мониторинга эффективности терапии, прогноза развития осложнений и исхода заболевания. Важными факторами должны являться также легкость сбора материала, неинвазивный характер, быстрота исследования, возможность стандартизации в различных клинических лабораториях и точность методики измерения [11, 12]. Биомаркер должен отвечать требованиям концепции SMART, то есть быть:

S – specific and sensitive – чувстви...

Никитина И.В., Непша О.С., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю., Милая О.В., Дегтярева А.В., Ионов О.В., Зубков В.В., Дегтярев Д.Н.