Создание методов сравнительного протеомного анализа мочи беременных и небеременных женщин для исследования процессов, протекающих при беременности

Цель исследования. Получение экспериментальных данных о протеоме мочи беременных при физиологической беременности для повышения диагностической значимости выявляемых в моче маркеров различных заболеваний.
Материал и методы. Для стандартизации протокола сбора мочи были отобраны образцы мочи 10 небеременных женщин в возрасте от 24 до 34 лет. Выбрана вторая утренняя моча как объект исследования и время 20 минут как рекомендуемое время хранения образца на льду до предварительной обработки. Для стандартизации протокола сбора мочи беременных для последующего протеомного анализа были отобраны образцы мочи 10 женщин на 15–17-й неделе беременности в возрасте от 23 до 35 лет, с нормально протекающей беременностью с общим содержанием белка в моче не выше 100 мкг/мл (отсутствие протеинурии). Пробы мочи анализировались на базе нанопоточного высокоэффективного жидкостного хроматографа (нано-ВЭЖХ, nano-HPLC) Agilent 1100 (Agilent, США) и масс-спектрометра FinniganLTQ FT (ThermoElectron, Бремен, Германия).
Результаты. Разработан и стандартизирован протокол выделения белковых экстрактов из проб мочи, включающий процедуру первичного отбора проб мочи у пациенток и экстрагирование белковых смесей из проб мочи. В ходе исследования показана высокая воспроизводимость и информативность протеомных данных состава мочи беременных, что позволяет нам предложить данный протокол для определения изменений протеома мочи, связанных с беременностью, определения характерных качественных изменений белкового профиля мочи при беременности, исследования возможности использования выявленных белковых молекул в качестве биомаркеров для ранней диагностики различных заболеваний, связанных с беременностью.

Белки и пептиды являются природными химическими биополимерами, играющими важнейшую роль в функционировании организмов. Исследованием структуры и функций белков занимается недавно возникшая наука – протеомика. Белки в организме подвергаются посттрансляционному модифицированию, таким образом, многообразие белков в организме превышает количество кодирующих их генов на несколько порядков. По этой причине идентификация белков и пептидов является значительно более сложной задачей, чем идентификация генов. В геномике разработаны разнообразные методики мультиплицирования молекул ДНК, однако нет возможности мультиплицирования белков, что значительно повышает требования к чувствительности анализа.

Метод масс-спектрометрического анализа является одним из старейших физических методов анализа веществ, обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Открытие новых методов недеструктивной ионизации больших биомолекул, включая ДНК, РНК, белки и пептиды, позволило масс-спектрометрии стать одним из основных инструментов молекулярной биологии и биохимии, в том числе в протеомных исследованиях биологических жидкостей сложного гетерогенного состава (кровь, моча, слюна, спинномозговая жидкость, тканевые экстракты и др.).

Моча представляется исключительно удобным объектом для протеомного исследования благодаря неинвазивности методики сбора и большим объемам анализата, что позволяет повторять отбор образцов много раз и в течение длительного времени. Несмотря на то что исследованию белкового состава мочи посвящено множество работ [1–9], на данный момент отсутствуют стандартизированные подходы сбора и протеомного анализа мочи беременных. Лишь небольшая часть исследований протеома мочи имеет отношение к изучению физиологических закономерностей формирования ее белкового состава в силу ограничения доступа исследователей к биологическим образцам здоровых лиц. Чаще всего в качестве «контрольных» групп в исследованиях, посвященных поискам маркеров (или созданию диагностических «панелей» белковых маркеров) различных заболеваний, используются группы пациентов с исключенным диагнозом основного изучаемого заболевания, которые не могут быть отнесены к категории здоровых индивидуумов. Таким образом, целью данной работы стало получение экспериментальных данных о протеоме мочи беременных при физиологической беременности для повышения диагностической значимости выявляемых в моче маркеров различных заболеваний. В рамках данной задачи нами разработан протокол выделения белковых экстрактов из проб мочи. Для этого стандартизированы процедуры первичного отбора проб мочи у пациенток и процедура экстрагирования белковых смесей из проб мочи. Процедуры сбора мочи/выделения белка разрабатывались с целью минимизировать время анализа при сохранении достаточно высокого (несколько сотен) количества белков для последующего проведения сравнительного скрининга.

Материал и методы исследования

Белок выделялся из образцов согласно протоколу пробоподготовки, разработанному нашей группой для мочи небеременных женщин и здоровых мужчин [8]. Пробы мочи анализировались на базе нанопоточного высокоэффективного жидкостного хроматографа (нано-ВЭЖХ, nano-HPLC) Agilent 1100 (Agilent, США) и масс-спектрометра FinniganLTQ FT (ThermoElectron, Бремен, Германия). Комбинация высокоточного ИЦР (ион-циклотронного резонанса) масс-спектрометрии [9] и высокоэффективной жидкостной хроматографии дает возможность реализовать метод быстрого протеомного скрининга методом AMT (точной массовой метки и времени хроматографического удержания) [8, 10, 11]. Объем вводимой на колонку пробы составлял 1 мкл образца, использовалась колонка 75 мкм×12 см с фазой Reprosil-PurBasic C18, 3 мкм (Аммербух-Энтринген, Германия), изготовленная в лаборатории. Проводилась градиентная хроматография с линейным увеличением относительного содержания растворителя B в потоке от 3 до 50% за 40 минут (растворитель А: 0,1% муравьиной кислоты, растворитель В: 0,1% муравьиной кислоты). Масс-спектрометрический анализ фракций пептидов после трипсинолиза осуществляется при помощи программы Xcalibur (ThermoElectron, Бремен, Германия) в 2-стадийном режиме автоматического измерения спектров. На первом этапе в ИЦР масс-спектрометре ИЦР измерялись точные массы пептидов (m/z 300–1600, R=50000 для m/z 400, число ионов в ячейке ИЦР 5×106), затем из ИЦР масс-спектра выбирались четыре максимальных пика с динамическим исключением, для которых производилась столкновительно-индуцированная фрагментация (CID).

Поиск и идентификация белков проводился по базе данных IPI-human (версия 3.82; 06.04.2011) при помощи программы Mascot (MatrixScience, Лондон, Великобритания; version 2.0.04). Считалось, что белок достоверно идентифицирован, если для него нашлось более 2 пептидов (Score>24). Обнаруженные белки и пептиды валидировались с использованием программы Scaffold 4.0 (версия Scaffold-01_07_00, ProteomeSoftwareInc., Portland, OR). Считалось, что пептид идентифицирован верно, если вероятность его определения была более 95,...

Стародубцева Н.Л., Вавина О.В., Ходжаева З.С., Кононихин А.С., Попов И.А., Бугрова А.Е., Усманова З.И., Костюкевич Ю.И., Высоких М.Ю., Кан Н.Е., Николаев Е.Н., Сухих Г.Т.