Сравнительная оценка эффективности действия различных доз статинов на очаги эндометриоза при его экспериментальной модели

01.12.2010
1654

ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава

Целью проспективного рандомизированного исследования являлось определение влияния аторвастатина на экспериментально индуцированный эндометриоз у крыс. У 21 самки крыс линии Вистар был индуцирован эндометриоз трансплантацией аутологичных тканей рога матки к ткани брюшины, после чего методом случайной выборки они были разделены на 3 группы. Животные 1-й группы (низкие дозы аторвастатина, 7 крыс) получали per os 0,5 мг аторвастатина на 1 кг массы тела в день. Животные 2-й группы (высокие дозы аторвастатина, 7 крыс) получали per os 2,5 мг аторвастатина на 1 кг массы тела в день. В 3-й группе (контрольная, 7 крыс) животные не получали никакого лечения. Введение препарата продолжалось в течение 21 дня, после чего животные подвергались эвтаназии для определения морфологических, морфометрических параметров имплантов и уровня экспрессии в них сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР). В конце лечения во 2-й группе площадь имплантов, а также экспрессия СЭФР в тканях были значительно меньше, чем в 1-й и контрольной группах (р< 0,05). Во 2-й группе площадь имплантов уменьшилась с 16,1±0,49 до 4,0±0,29  мм², экспрессия СЭФР в строме снизилась с 1,71± 0,05 до 0,54±0,03, тогда как в 1-й и 3-й группах наблюдалось увеличение размеров имплантов с 13,5±0,83 до 14,3±0,74 мм² и с с 14,4±0,58 до 15,1±0,29  мм² соответственно. Исследование показало, что высокие дозы статинов вызывают значительный регресс эндометриальных имплантов.

На сегодняшний день одной из наиболее актуальных проблем медицины является эндометриоз. Частота этого заболевания в популяции составляет от 15 до 70% у женщин репродуктивного возраста и до 50 % у обследующихся по поводу бесплодия [3, 21, 24]. Хирургический метод в лечении эндометриоза является первостепенным, но не всегда достаточным: у 20—30% больных с распространенными формами эндометриоза возникает рецидив заболевания [1].

Несмотря на увеличение числа научных и клинических исследований, посвященных разным аспектам эндометриоза, значительное количество вопросов относительно диагностики, частоты, особенностей течения и терапии остаются нерешенными. Недостаточно понятны и механизмы развития болезни. Ни одна из предложенных концепций не может полностью объяснить его патогенез и разнообразие локализаций очагов эндометриоза.

Одной из наиболее распространенных является имплантационная теория, согласно которой происходит ретроградный заброс в брюшную полость клеток эндометрия, отторгнувшихся во время менструации, и их дальнейшая имплантация на окружающих органах и брюшине [19]. Поскольку ретроградный заброс менструальной крови наблюдается у большинства женщин репродуктивного возраста, заболевание развивается лишь в результате сосуществования дефекта клиренса менструальной крови с брюшины малого таза с возможными нарушениями в иммунной системе. В результате повышенной экспрессии цитокинов, фактора роста макрофагов (MDGF),фактора некроза опухоли α (TNF-α), сосудисто-эндотелиального фактора роста (СЭФР, или VEGF), моноцитарного хемотаксического белка(MCP-1) происходит имплантация и рост эндометриальных клеток [6, 7, 12, 15, 25].

Ангиогенез является физиологическим процессом, вовлеченным в эмбриональное развитие, заживление раны, лежит в основе всех процессов репродуктивного цикла женщины. Уникальность эндометрия заключается в способности к стремительному циклическому росту, секреции, регрессу и регенерации в течение каждого менструального цикла [17]. Процесс ангиогенеза, как правило, подавляется в нормальных тканях взрослого организма, за исключением онкологической патологии и таких заболеваний, как псориаз, ретинопатия и эндометриоз [5, 22]. Ангиогенез представляет собой многоэтапныйкомплекс с участием различных проангиогенных факторов роста, таких как СЭФР, или VEGF, основной фактор роста фибробластов (BFGF), а такжеингибитора ангиогенеза тромбоспондина-1 (TSP-1) и т.д. Это так называемый чистый баланс факторов, определяющий финал ангиогенного фенотипа патологических феноменов, таких как опухоли и эндометриальные повреждения [10, 11, 24].

Давно известно, что эндометриоз вызывает местное воспаление, нарушения в фибринолитической системе, а именно снижение тканевого активатора плазминогена (TPA), повышение ингибитора активатора плазминогена (PAI), в результате чего происходит образование плотных фибриновых нитей, являющихся ключевым фактором в развитии спаечного процесса [2, 6].

Сегодня в мире широкое применение нашла группа препаратов, ингибиторов 3-гидрокси­3-метилглутарил-коэнзим А (HMG-CoA) редуктазы — статины. Общеизвестно, что данные препараты снижают синтез холестерина, эффективны при первичной и вторичной профилактике атеросклероза и коронарного синдрома. Недавние исследования наглядно демонстрируют антиангиогенный и противовоспалительный эффект этих препаратов [2, 4, 13, 14, 16, 20].

Цель настоящего исследования — изучение влияния статинов на очаги эндометриоза в эксперименте.

Материал и методы исследования

Экспериментальный эндометриоз индуцировали у крыс-самок линии Вистар (разводки питомника «Столбовая») массой 160—180 г, находящихсяв фазе проэструса. Животные содержались в виварии в условиях регулируемого светового дня (12×12 ч) и постоянной комнатной температуры (23±2°С), на стандартном пищевом рационе и при свободном доступе к воде. Все эксперименты проводили в соответствии с требованиями Женевской конвенции «International Guiding Principlesfor Biomedical Research Involving Animals» (1990 г.).

Техника оперативного вмешательства

Оперативные вмешательства проводили на иммобилизационном станке под золетиловым (производство Virbac Sante Animal, Франция) наркозом в течение 35—40 мин. Препарат вводили в дозе 5 мг на 1 кг массы тела. Для премедикации за 15 мин до инъекции золетила использовался препарат Ксила (Interchemie, Нидерланды). Препарат вводили в дозе 0,1 мл на 1 кг массы тела. Крысе-самке в асептических условиях, под наркозом, после предварительной химической депиляции кожи с использованием крема «Veet» производили нижнюю срединную лапаротомию для обнаружения органов репродуктивной системы.

I этап эксперимента

Моделирование эндометриоза осуществлялось по ранее описанной методике [23]. Производили лигирование левого маточного рога на протяжении 5 мм. После удаления окружающей жировой ткани сегмент левого маточного рога помещали в теплый изотонический раствор. Фрагмент маточного рога (миометрий с эндометрием) размером 3×3 мм пришивали к брюшине на передней брюшной стенке с помощью викриловой нити 5/0 на атравматичной колющей игле. Брюшину, мышцы, апоневроз ушивали непрерывными викриловыми швами. На кожу накладывали отдельные этибондовые швы. После I этапа операции животные находились под наблюдением в течение 5 нед для приживления имплантов без какого-­либо медикаментозного лечения.

II этап эксперимента

Целью второй лапаротомии были выявление полученных эндометриальных имплантов, измерение их размеров, биопсия с последующей гистологической и иммуногистохимической оценкой материала. В последующие 3 дня после операции животным предоставлялся физический покой, после чего животные рандомизированно были разделены на 3 группы. Животные 1-й группы (низкие дозы аторвастатина, 7 крыс) получали 0,5 мг/кг оральногоаторвастатина (препарат липримар производства Пфайзер Интернешнл, Германия). Животные2-й группы (высокие дозы аторвастатина, 7 крыс) получали 2,5 мг/кг орального аторвастатина. Животные 3-й группы (контрольная группа, 7 крыс) не получали никакого лечения. Медикаментозное лечение осуществлялось посредством орогастрального зонда и продолжалось в течение 21 дня согласно ранее описанной методике [14].

III этап эксперимента

После завершения медикаментозного лечения под золетиловым наркозом выполняли третью лапаротомию и затем животных подвергали эвтаназии. Измеряли размеры имплантов, после чего импланты иссекали в пределах окружающей ткани и фиксировали материал в 10% нейтральном растворе формалина для последующей гистологической и иммуногистохимической оценки с применением морфометрического анализа.

Гистологический метод. Материал фиксировали в 10% нейтральном забуференном растворе формалина и по общепринятой методике заливали в парафиновые блоки. Гистологические срезы толщиной 4—5 мкм, полученные на микротоме «Leica» (Германия), окрашивали гематоксилиноми эозином.

Иммуноморфологический метод. Для иммуноморфологического исследования использовали непрямой иммунопероксидазный метод с применением первичных (специфических) моноклональных антител: к СЭФР, клон G153-694 производства Lab Vision (США).

Гистологические срезы толщиной 4—5 мкм, изготовленные из парафиновых блоков с помощью микротома «Leica» (Германия), помещалина покрытые специальным адгезивом (APES-ацетон) предметные стекла. Эндогенную пероксидазу в депарафинированных срезах блокировали 3% перекисью водорода. Демаскировку антигенов производили по стандартной схеме в микроволновой печи в течение 20 мин при 600 В в 0,1 М растворе цитратного буфера (рH 6,0). После инкубациигистологических срезов с первичными антителами (рабочее разведение антисывороток 1:50—100, время инкубации 45—60 мин при температуре 37ºС) их обрабатывали вторичными биотилированными антикроличьими иммуноглобулинами.

Для последующей визуализации результата реакции связывания антигена с антителом использовали систему детекции «Ultra Vision LP Value HRP Polymer» (Lab Vision, США). Применяли фермент (пероксидазу хрена) в присутствии субстрата (перекиси водорода) и специального реактива (3,3-диаминобензидин).

Конечный продукт реакции представляет собой мелкие коричневатые гранулы в участках локализации антигена. Для СЭФР — цитоплазма и клеточные мембраны клеток, в определенной мере — экстрацеллюлярный матрикс (депо факторов роста).

Проводили общепринятые отрицательные и положительные контрольные процедуры на используемые реагенты и ткани при обработке параллельных срезов. Отрицательный контроль заключался в проведении реакции с исключением первичных, специфических антител (путем их замены неиммунным реактивом — бычьей сывороткой). Положительный контроль осуществлялся использованием гистологических препаратов эндометрия в фазу пролиферации.

После проведения иммунопероксидазной реакции гистологические препараты докрашивали гематоксилином, изучали и фотографировали, используя световой микроскоп DM-LB («Leica», Германия).

Морфометрический метод. Результаты иммуногистохимической реакции оценивали с помощью полуколичественного морфометрического метода [9]. Вычисляли коэффициент экспрессии СЭФР по общепринятой схеме. Визуально оценивали интенсивность окраски клеток в баллах от 0 до 3 (отрицательная, слабая, умеренная и выраженная), подсчитывали процент позитивно окрашенных клеток при каждом значении интенсивности окраски (минимум для 500 эпителиальных и 500стромальных клеток эндометрия в 10 полях зрения при увеличении микроскопа ×400).

Коэффициент экспрессии рассчитывали для каждого наблюдения по формуле, где б — интенсивность окраски в баллах (от 0 до 3), П — процент окрашенных клеток (от 0 до 100) при каждом значении б.

Статистическую обработку экспериментального материала проводили с помощью статистических программ Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corp., США) и Statistica 6.0 for Windows (StatSoftInc., США) с соблюдением общих рекомендаций для медицинских и биологических исследований.

Результаты исследования и обсуждение

Основные исследуемые параметры и полученные результаты приведены в таблице. К началу эксперимента масса тела животных колебалась от 160,4±2,96 до 170,3±5,17 г. К моменту окончания эксперимента отмечалось незначительное, статистически незначимое снижение массы тела животных. Размеры имплантов при второй операции были сопоставимы в 3 исследуемых группах и составляли 13,5±0,83; 16,1±0,49 и 14,4±0,58 мм² соответственно. После лечения (при третьей опе­рации) в 1-й и 3-й группах отмечалось незна­чительное увеличение размеров имплантов — с 13,5±0,83 до 14,3±0,74 мм² и с 14,4±0,58 до 15,1±0,29 мм² соответственно (р>0,05), тогда как во 2-й группе выявлено резкое (более чем в 4 раза)уменьшение размеров имплантов – с 16,1±0,49 до 4,0±0,29 мм² (p<0,05). Визуальная характеристика имплантированных очагов эндометриоза в трех исследуемых группах при последней операции представлена на рис. 1 (см. на вклейке).

Экспрессия СЭФР в эпителии обычно кистозно-расширенных желез (ЭКРЖ) до лечения колебалась в пределах от 2,20±0,13 до 2,25±0,08. После лечения в 1-й и 3-й группах отмечалось некоторое увеличение экспрессии СЭФР в ЭКРЖ — с 2,21±0,05 до 2,53±0,1 и с 2,20±0,13 до 2,52±0,07 соответственно (p>0,05), тогда как во 2-й группе имело место статистически незначимое уменьше­ние экспрессии СЭФР в ЭКРЖ — с 2,25±0,08 до 2,0±0,12 (p>0,05).

Экспрессия СЭФР в строме до лечения колебалась в пределах от 1,70±0,9 до 1,72±0,03. После лечения в 1-й и 3-й группах отмечалось увеличение экспрессии СЭФР в строме с 1,70±0,9 до 1,9±0,1 и с 1,72±0,03 до 1,93±0,02 соответственно (p>0,05), тогда как во 2-й группе отмечалось статистически значимое уменьшение экспрессии СЭФР в строме более чем в 3 раза ‒ с 1,71±0,05 до 0,54±0,03 (p<0,05).

Гистологическая и иммуноморфологическая характеристика экспериментальных очагов эндометриоза представлена на рис. 2—4 (см. на вклейке). Обращает на себя внимание тот факт, что только в группе животных, получавших высокие дозы статинов, удалось вызвать склероз и атрофию очага эндометриоза (см. рис.3 на вклейке).

Недавние исследования наглядно демонстрируют ингибирующее действие статинов на процессы ангиогенеза наряду с их способностью снижать уровень липопротеидов [18]. Действие статинов на ангиогенездозозависимое и бифазное: в низких дозах они дают проангиогенный эффект путем активации серин/треонинпротеинкиназы B (akt), увеличивая продукцию оксида азота, тогда как в высоких дозах ингибируют систему белковой изопрениляции, включая такие субстраты, как геранил-геранилпирофосфат, фарнезилпирофосфат, играющие ключевую роль при пролиферации клеток, апоптозе и экспрессии генов [8, 20].

В 2006 г. появилась первая публикация о влиянии статинов на очаги эндометриоза. Группой ученых из Йельского университета (Нью-Хейвен, Коннектикут, США) и Польской академии центра научных исследований (Варшава) во главе с Петром Петровским продемонстрирован ингибирующий эффект мевастатина и симвастатина на клеточную пролиферацию при эндометриозе на модели invitro [16].

Через год появились данные об эффективности ловастатина при эндометриозе на модели in vitro [13]. Канадские ученые уточнили, что в присутствии низких доз ловастатина происходит только ингибирование ангиогенеза, тогда как под воздействием высоких доз ловастатина имеет место ингибирование ангиогенеза и клеточной пролиферации.

Следующим прорывом научных исследований, подтверждающим ингибирующее действие статинов в очагах эндометриоза, являются экспериментальные данные ученых университетской больницы баскент (Анкара, Турция) во главе с M. Oktem[14].

В 2009 г. появились данные о роли симвастатина в предотвращении развития эндометриоза на модели экспериментальных мышей, полученные исследователями Научно-исследовательского центра репродуктивного здоровья женщин и Вандербильтского университета (Нэшвилл, Теннесси, США) во главе с К.L. Bruner-Tran. В исследовании также приводятся убедительные данные об ингибирующем действии высоких доз статинов в очагах эндометриоза, снижении объема имплантов на 98% [4].

Наши экспериментальные данные показывают уменьшение размеров эндометриоидныхимплан­тов практически в 4 раза, снижение экспрес­сии СЭФР в стромальном компоненте более чем в 3 раза по сравнению с контрольной группой. По сути, результаты нашего исследования дока­зывают ингибирующее влияние статинов на очаг эндометриоза при условии соблюдения режима дозирования. Однако приемлемо ли использова­ние достаточных доз статинов в клинической практике?

Сегодня аторвастатин выпускается в суточной дозировке 10, 20, 40, 80 мг. Как видно, 80 мг — это максимально допустимая суточная доза препа­рата. В недавнем проспективномрандомизиро­ванном исследовании, включающем более 10 000 больных, было показано, что терапия аторваста­тином в дозе 80 мг в день с целью интенсивного снижения уровня липидов у больных со стойким коронарным синдромом оказывает более значимый клинический эффект, чем лечение в дозе 10 мг в день. Однако лечение высокими дозами статинов (80 мг в день) вызывает несколько боль­шее увеличение аминотрасфераз по сравнению с низкими дозами (10 мг в день) (1,2 против 0,2%соответственно). Несмотря на это, повышение уровня аминотрансфераз при лечении высокими дозами аторвастатина носит преходящий характер и не приводит к заболеваниям печени [10]. По-видимому, представленный положительный опыт клинического применения высоких доз статинов может быть учтен и при лечении больных эндометриозом.

Таким образом, представленные результаты демонстрируют высокую эффективность статинов, что свидетельствует о необходимости продолжения экспериментальных исследований и является важным шагом на пути разработки клинических рекомендаций по применению статинов в лечении эндометриоза.

Список литературы

1. Адамян Л.В., Кулаков В.И., Андреева Е.Н. Эндометриозы. — М.: «Медицина», 2006.

2. Aarons C.B., Cohen P.A., Gower A. et al. Statins (HMG-CoA reductase inhibitors) decrease postoperative adhesions by increasing peritonealfibrinolytic activity // Ann. Surg. — 2007. — Vol. 245, № 2. — P. 185—186.

3. Amsterdam L.L., Gentry W., Jobanputra S.et al., Wolf M, Rubin SD and Bulun SE. Anastrazole and oral contraceptives: a novel treatment for endometriosis// Fertil. andSteril. — 2005. — Vol. 84, № N 2. — P. 300—304.

4. Bruner-Tran K.L., Osteen K.G., Duleba A.J. Simvastatin protects against the development ofendometriosis in a nude mouse model // J. Clin.Endocrinol. Metab. — 2009. — Vol.94, № 7. — P. 2489—2494.

5. Folkman J. Seminars in Medicine of the Beth Israel Hospital, Boston. Clinical applications of researchon angiogenesis // N. Engl. J. Med. — 1995. — Vol. 333, № 26. — P. 1757—1763.

6. Gazvani R., Templeton A. Peritoneal environment, cytokines and angiogenesis in the pathophysiologyof endometriosis // Reproduction. — 2002. — Vol. 123, № 2. — P. 217—226.

7. Halme J., White C., Kauma S. et al., Estes J, Haskill S. Peritoneal macrophages from patientswith endometriosis release growth factor activityin vitro // J. Clin. Endocrinol.Metab. — 1988. — Vol. 66, № 5. — P.1044—1049.

8. James K. Liao Isoprenoids as mediators of thebiological effects of statins // J. Clin. Invest. — 2002. — Vol. 110, № 3. — P. 285—288.

9. Kinsel L.B., Szabo E., Greene G.L. et al., Konrath J, Leight GS, McCarty KS Jr. Immunocytochemicalanalysis of estrogen receptors as a predictor ofprognosis in breast cancer patients: comparisonwith quantitative biochemical methods // CancerRes. — 1989. — Vol. 49, № 4. — P.1052—1060.

10. LaRosa J.C., Grundy S.M., Waters D.D., Shear C, Barter P, Fruchart JC, GottoAM,Greten H, Kastelein JJ, Shepherd J, et al. Intensive lipidlowering with atorvastatin in patients with stablecoronary disease // N. Engl. J . Med. — 2005. — Vol. 352, № 14. — P.1425—1435.

11. Maas J.W., Le Noble F.A., Dunselman G.A., de Goeij AF, et al.StruykerBoudier HA and Evers JLThe chick embryo chorioallantoic membrane asa model to investigate the angiogenicpropertiesof human endometrium // Gynecol. Obstet.Invest. — 1999. — Vol.48, № 2. — P.108—112.

12. Na Y.J., Jin J.O., Lee M.S. et al., Song MG, LeeKS, Kwak JY. Peritoneal fluid from endometriosis patients switches differentiation of monocytesfrom dendritic cells to macrophages // J. Reprod.Immunol. — 2008. — Vol.77, № 1. — P.63—74.

13. NavidEsfandiari, D.V.M., Ph.D., MozafarKhazaei, Ph.D., Jafar Ai et al., Ph.D.,RyszardBielecki, D.V.M., Lynda Gotlieb, R.N., Edward Ryan, M.B., B.Ch.,and Robert F. Casper, M.D. Effect of a statin on an in vitro model of endometriosis // Fertil. andSteril. — 2007. — Vol.87, № 2. — P. 257—262.

14. Oktem M., Esinler I., Eroglu D. et al., Haberal N, Bayraktar N, Zeyneloglu HB. High-doseatorvastatin causes regression of endometrioticimplants: a rat model // Hum. Reprod. — 2007. — Vol. 22, № 5. — P.1474—1480.

15. Oral E., Seli E., Bahtiyar M.O. et al., Olive DL, Arici A. Growth-regulated alpha expression in the peritoneal environment with endometriosis // Obstet.Gynecol. — 1996. — Vol.88, № 6. — P. 1050—1060.

16. PiotrowskiP.C.,KwintkiewiczJ.,RzepczynskaI.J. etal., Seval Y, Cakmak H, Arici A, Duleba AJ. Statinsinhibit growth of human endometrial stromal cellsindependently of cholesterol availability // Biol.Reprod. — 2006. — Vol. 75, № 1. — P. 107—111.

17. RisauW. Mechanisms of angiogenesis // Nature. —1997. — Vol.386, № (6626). — P. 671—674.

18. RutishauserJ. The role of statins in clinical medicine—LDL—cholesterol lowering and beyond // Swiss.Med. Wkly. — 2006. — Vol.136. — P. 41—49.

19. SampsonJ.A. Metastatic or Embolic Endometriosis,due to the Menstrual Dissemination of EndometrialTissue into the Venous Circulation // Am. J.Pathol. — 1927— Vol.3, № N2. — P. 93—110.43

20. Skaletz-RorowskiA.,WalshK. Statin therapy andangiogenesis // Curr. Opin.Lipidol. — 2003. —Vol. 14, № 6. — P. 599—603.

21. StrathyJ.H.,MolgaardC.A.,CoulamC.B.,etalMelton LJ. Endometriosis and infertility—alaparoscopic study of endometriosis among fertileand infertile women // Fertil. andSteril. —1982. — Vol. 38. — P. 667—672.

22. TaylorR.N.,LebovicD.I.,MuellerM.D.Angiogenicfactors in endometriosis // Ann. N. Y. Acad.Sci. — 2002. — Vol. 955. — P.89—100.

23. VernonM.W.,WilsonE.A.: Studies on the surgicalinduction of endometriosis in the rat // Fertil. andSteril. — 1985. — Vol. 44, № 5. — P.684—694.

24. WheelerJ.M.: Epidemiology and prevalence ofendometriosis // Infertil. Reprod. Med. Clin.North.Am. — 1992. —№ N 3. — P. 545—549.

25. YancopoulosG.D.,DavisS.,GaleN.W., et al. RudgeJS, Wiegand SJ, Holash J. Vascular-specific growthfactors and blood vessel formation // Nature. —2000. — Vol. 407. № (6801). — P. 242—248.

Об авторах / Для корреспонденции

Гулиев МурадТофигоглы, аспирант каф.репродуктивной медицины и хирургии фак-та последипломного образования ГОУ ВПО Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава
Адрес: 103473, Москва, ул. Делегатская, д. 20/1
E-mail: doctor_guliev@mail.ru

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь

Статьи по теме

Все номера

Смотрите также