Сравнительный анализ степени надежности данных о молекулярном кариотипе эмбриона, получаемых методами полногеномной амплификации на основе технологии секвенирования следующего поколения (NGS) отдельных клеток трофэктодермы

Анеуплоидии у эмбрионов человека вносят существенный вклад в этиологию неудач имплантации и ранних репродуктивных потерь в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Наиболее распространенным методом оценки плоидности эмбриона является преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (ПГТ-А). Внедрение ПГТ-А в клиническую практику позволило значительно снизить вероятность переноса анеуплоидного эмбриона в полость матки и повысить эффективность программ ВРТ. Существуют преимущества и недостатки различных методов ПГТ-А и способов забора материала для анализа, а также имеется ряд причин возможных ложноположительных и ложноотрицательных результатов ПГТ-А. Поскольку для исследования берется всего несколько клеток, большое значение для получения достоверных результатов анализа имеет равномерность амплификации ДНК; в связи с чем ключевым и самым важным этапом ПГТ-А является полногеномная амплификация ДНК (whole genome amplification, WGA). 
В статье приведен анализ современных данных литературы, посвященной исследованию оценки эффективности и надежности методов масштабирования малых количеств ДНК; приведены результаты собственного исследования по сравнительному анализу методов полногеномной амплификации отдельных клеток трофэктодермы с целью получения надежных данных о молекулярном кариотипе эмбриона методом NGS. Показана эффективность использования отечественных наборов WGA. 
Заключение: Сравнение результатов ПГТ-А с использованием различных наборов показало применимость разработанного нами «гибридного» протокола, где могут использоваться как зарубежные наборы для полногеномной амплификации, так и отечественные. Данный подход показал высокую надежность наборов WGA с SD-полимеразой для подготовки материала к проведению ПГТ эмбрионов человека, а также может найти применение в других областях биомедицины и судебно-медицинских исследований, где востребована высокая надежность и точность амплификации предельно малых количеств ДНК.

Вклад авторов: Леонтьева О.А. – культивирование эмбрионов, биопсия клеток трофэктодермы; Глотов О.С., Сайфитдинова А.Ф., Павлова О.А., Полякова И.В. – пробоподготовка, полногеномная амплификация, NGS;
Глотов О.С., Сайфитдинова А.Ф. – анализ данных; Глотов О.С., Сайфитдинова А.Ф., Масленников А.Б – написание текста, редактирование. 
Конфликт интересов: Авторы статьи заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование: Работа выполнена без спонсорской поддержки.
Благодарность: Авторы выражают благодарность Пуппо (Трофимовой) И.Л., сотруднику Национального медицинского исследовательского центра им. В.А. Алмазова, за инициацию работы по сбору эмбрионов для проведения исследований.
Одобрение Этического комитета: Сбор материала для исследования осуществлялся на основе ИДС с донорами, утвержденных локальным этическим комитетом Национального медицинского исследовательского центра
им. В.А. Алмазова (№ 02-21 от 15 февраля 2021 г.).
Согласие пациентов на публикацию: Пациенты подписали информированное согласие на публикацию своих данных.
Обмен исследовательскими данными: Данные, подтверждающие выводы этого исследования, доступны по запросу у автора, ответственного за переписку, после одобрения ведущим исследователем.
Для цитирования: Глотов О.С., Сайфитдинова А.Ф., Павлова О.А., Леонтьева О.А., Полякова И.В., Масленников А.Б. Сравнительный анализ степени надежности данных о молекулярном кариотипе эмбриона, получаемых методами полногеномной амплификации на основе технологии секвенирования следующего поколения (NGS) отдельных клеток трофэктодермы.
Акушерство и гинекология. 2024; 6: 66-74
https://dx.doi.org/10.18565/aig.2024.78

Анеуплоидии у эмбрионов человека вносят существенный вклад в этиологию неудач имплантации и ранних репродуктивных потерь в программах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Для снижения риска переноса в полость матки эмбриона с хромосомной патологией проводят преимплантационное генетическое тестирование на анеуплоидии (ПГТ-А). Внедрение ПГТ-А в клиническую практику позволило повысить эффективность программ ВРТ; однако используемые в настоящее время методы ПГТ-А имеют ряд ограничений [1]. Причинами ложноположительных и ложноотрицательных результатов ПГТ-А и, как следствие, неправильной оценки кариотипа эмбриона могут стать как погрешности на этапе предварительных манипуляций с эмбрионом, способы забора материала, так и непосредственно молекулярно-

генетические исследования биоптата. Основными и наиболее частыми проблемами являются загрязнение материала при биопсии и неравномерная полногеномная амплификация ДНК (Whole Genome Amplification, WGA) [2].

Было показано, что в среднем загрязнение случается в 0,4% образцов биопсии, но в некоторых клиниках оно может быть значительно более распространенным [2]. Поэтому важен постоянный контроль возможного загрязнения для исключения неправильного диагноза.

До недавнего времени большинство коммерчески доступных платформ для ПГТ-А использовали амплификацию всего генома с последующим секвенированием случайной выборки фрагментов ДНК, разбросанных по всему геному, с использованием технологии секвенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing, NGS). Однако простые количественные измерения фрагментов ДНК, полученных из каждой хромосомы, обеспечиваемые такими методами, не могут выявить, загрязнен ли образец биопсии неэмбриональной ДНК. Отрицательный контроль редко используется во время ПГТ-А и является неадекватным, поскольку не позволяет оценить загрязнение в самой пробирке, содержащей биопсийный образец.

С целью выяснения частоты случаев контаминации было проведено ретроспективное исследование, включавшее анализ 49 287 образцов биопсии трофэктодермы, по которым проводилась ПГТ-А [2]. Эмбрионы, у которых был обнаружен контаминированный биоптат, обычно подвергались повторной биопсии. В таких случаях результаты двух образцов сравнивались, чтобы установить, имела ли место ошибка при установке исходного результата за­грязненного образца, если бы анализ ограничивался изучением только относительного числа копий хромосом, как это имеет место в большинстве методов ПГТ-А, основанных на NGS. Для идентификации реального происхождения данных из образцов использовался анализ однонуклеотидного полиморфизма (SNP) в продуктах полногеномной амплификации. Генотип каждого SNP и относительное количество фрагментов ДНК, содержащих каждый из различных аллелей, позволяют обнаруживать триплоидию, гаплоидию и контаминацию. Из 49 287 проанализированных биоптатов загрязнение неэмбриональной ДНК было обнаружено в 218 (0,44%). В 25 клиниках, предоставивших образцы, наблюдались различия в показателях контаминации, которые варьировали от 0 до 1,5%, хотя в одной из клиник уровень контаминации составил 7,7% (при количестве биопсий 26) [2].

Результаты были разделены на 3 категории: 1) отсутствие изменений в интерпретации между первым (загрязненным) и вторым образцами биопсии; 2) ложноположительный результат – загрязненный образец был эуплоидным, но был бы ошибочно интерпретирован как триплоидный и ошибочно отброшен, что потенциально повлияло бы на эффективность ВРТ; 3) ложноотрицательный – загрязненный образец был полностью анеуплоидным, но был бы неправильно классифицирован как мозаичный или эуплоидный и мог бы быть пригоден для переноса, что потенциально привело бы к неудаче имплантации или аномальной беременности. Ложноотрицательный результат был получен в 19% загрязненных образцов, в то время как в 24% – получен ложноположительный результат, «имитировавший триплоидию» [2].

Авторы исследования подчеркивают ограничения и сложности своего исследования. А именно то, что невозможно с уверенностью определить происхождение загрязняющих веществ, не имея ДНК из источника загрязнения для сравнения. Кроме того, невозможно сделать вывод о том, является ли загрязнение более вероятным при проведении циклов экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) или интрацитоплазматической инъекции сперматозоида (ИКСИ), поскольку только 3% образцов были оплодотворены с помощью ЭКО [2].

Таким образом, обнаружение контаминации во время ПГТ-А важно для предотвращения ошибок при кариотипировании эмбриона. Пропущенная контаминация и, как следствие, неправильная оценка кариотипа могут привести к выбраковке потенциально жизнеспособных эмбрионов, что может способствовать переносу анеуплоидных эмбрионов, ошибочно классифицированных как мозаичные, и увеличить частоту неудач имплантации, выкидышей и анеуплоидных беременностей.

Второй не менее важной проблемой, которая мо­жет привести к неправильной интерпретации ре­зультатов ПГТ-А на анеуплоидию, является WGA. Проблемы, приводящие к неточной восп...

Глотов О.С., Сайфитдинова А.Ф., Павлова О.А., Леонтьева О.А., Полякова И.В., Масленников А.Б.