Свободная эмбриональная ДНК в прогнозировании исхода беременности при акушерской патологии

01.06.2014
1140

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, Москва

В обзоре излагаются современные представления о роли свободной эмбриональной ДНК (сэ-ДНК) в прогнозировании осложнений и исходов беременностей. Описаны методики, которые сделали возможным определение сэ-ДНК в крови беременных женщин вне зависимости от пола и резус-фактора плода. Изложены данные исследований, свидетельствующие о взаимосвязи повышенных уровней сэ-ДНК при самопроизвольном прерывании беременностей, преждевременных родах, преэклампсии, задержке роста плода. Также приведены результаты прогнозирования осложнений и диагностики анеуплоидий неинвазивным путем. Описаны возможности клинического применения данных методов как у беременных групп риска, так и в качестве скрининговых методик.

Проблема неинвазивной пренатальной диагностики интересует исследователей и клиницистов в связи с необходимостью своевременной постановки диагноза с минимальным риском для состояния матери и плода. О наличии свободной (внеклеточной) эмбриональной ДНК (сэ-ДНК) в плазме крови матери известно с 1997 г. [1], однако детальные исследования в этой области были проведены в течение последних десяти лет. Эмбриональная ДНК в плазме крови матери составляет небольшой процент относительно всей циркулирующей ДНК, по данным различных авторов 1–2% [2, 3].

Предполагается, что сэ-ДНК попадает в кровь матери несколькими путями: из фетальных клеток, переходящих плацентарный барьер и разрушающихся иммунной системой, в результате лизиса клеток плаценты и прямого выброса ДНК плода в кровь матери [4–6]. Сэ-ДНК обнаруживается уже на первых неделях развития плода (у 80% беременных женщин она обнаруживается на 28-й день после зачатия). Эти данные свидетельствуют о том, что сэ-ДНК появляется в крови матери раньше времени формирования системы кровообращения плода. В настоящее время многие работы подтверждают, что источником ДНК плода в материнском кровотоке являются клетки трофобласта.

Задача, стоящая перед исследователями, состоит в количественном определении ДНК плода на фоне большого количества ДНК матери. Некоторые локусы, такие как Y-хромосома или ген RHD (Rhesus D), у беременной с резус-отрицательной принадлежностью крови позволяют детектировать количество ДНК в плазме матери методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Определение наличия Y-хромосомы и гена RHD описано в мировой литературе и применяется в клинической практике. Однако таким образом можно определить ДНК плода только у 50% беременных женщин. На данный момент сэ-ДНК используется для неинвазивного пренатального определения пола и резус-фактора плода [7–10].

Новые открытия в эпигеномике сделали возможным использовать определение сэ-ДНК в течение беременности вне зависимости от пола плода. Существуют несколько способов определения доли свободной эмбриональной ДНК в крови матери вне зависимости от пола и резус-фактора плода. Все они основаны на обнаружении различий между ДНК, принадлежащей матери, и ДНК плода.

Одним из методов является определение ДНК плода на основании профиля метилирования. Данный метод основан на эпигенетических различиях между плодовой и материнской ДНК, а именно на различиях в метилировании плодовой ДНК и ДНК матери. В качестве мишеней используются гены, гиперметилированные у плода и гипометилированные у матери, что позволяет использовать чувствительные к метилированию рестриктазы. Подобные ферменты специфично разрушают неметилированную ДНК матери и оставляют только гиперметилированную ДНК плода. После этого становится возможной специфичная детекция свободной ДНК плода методом ПЦР в режиме реального времени [11–13].

К другим методикам относятся определение мутаций, унаследованных от отца, методом MALDI-TOF MS, матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация, анализ коротких тандемных повторов. Клиническое применение данных методик описано для неинвазивной пренатальной диагностики талассемии, ахондроплазии, миодистрофии, муковисцидоза и врожденной гиперплазии коры надпочечников.

Клиническое использование количественного измерения сэ-ДНК в настоящее время активно развивается. Еще в 1999 г. было обнаружено почти 5-кратное повышение сэ-ДНК плода в кровотоке матери при преэклампсии по сравнению с группой женщин с нормально протекающей беременностью [14]. Было установлено, что при преэклампсии происходит выброс в материнский кровоток клеток синцитиотрофобласта, микрочастиц, ДНК и РНК-молекул. Анализ данного материала может расширить понимание вклада плацентарных факторов в этиологию преэклампсии. При дальнейшем изучении этой патологии выявлен не только рост уровня сэ-ДНК, но и значительное повышение общего уровня ДНК матери, причем увеличение обоих показателей соответствовало степени тяжести преэклампсии [15]. Кроме того, было показано, что концентрация сэ-ДНК возрастает задолго до появления первых клинических симптомов. Так как ДНК плазмы является маркером клеточной гибели, повышенный уровень фетальной ДНК может быть результатом некроза и апоптоза клеток плаценты. С другой стороны, нарушение функции почек и печени, наблюдаемое при преэклампсии, ослабляет выведение циркулирующей ДНК из материнской крови. Кроме преэклампсии, были описаны и другие акушерские осложнения, при которых имеет место повышение уровня сэ-ДНК: преждевременные роды, тяжелая рвота беременных, плотное прикрепление плаценты или ее врастание, задержка роста плода (ЗРП), внутриматочные гематомы, многоводие, плацентарная недостаточность [16, 17].

Связь повышенного уровня сэ-ДНК с развитием плацентарной недостаточности была продемонстрирована в нескольких исследованиях. Так исследователями во Франции определен уровень сэ-ДНК у женщин с ЗРП в связи с преэклампсией (группа А, 19 женщин), при ЗРП вследствие других причин (группа В, 31 пациентка). Контрольная группа состояла из 28 женщин (группа С). В результате исследования были сделаны выводы, что уровень как общей, так и сэ-ДНК был достоверно выше при плацентарной недостаточности и ЗРП [18].

В Бристольском университете проводили оценку уровня сэ-ДНК в плазме крови матери во время нормальной беременности и сравнивали с осложненной беременностью (плацентарная недостаточность, преэклампсия и/или ЗРП). В исследование вошли 138 женщин, вынашивающих плод мужского пола, из них у 77 женщин беременность протекала нормально, у 49 осложнилась преэклампсией, у 12 были признаки ЗРП. Уровень сэ-ДНК был значительно выше у женщин с преэклампсией и с ЗРП, чем у женщин с нормальной беременностью, а также наблюдалась взаимосвязь высокого уровня сэ-ДНК со степенью тяжести преэклампсии [19] .

Группой ученых из Копенгагена было проведено исследование, в котором проанализирована взаимосвязь повышенного уровня сэ-ДНК у женщин с высоким риском преждевременных родов. Была обнаружена значительная связь между преждевременными родами и повышенным уровнем сэ-ДНК, точность метода составляла 95%.

Другое исследование было посвящено определению взаимосвязи между уровнем сэ-ДНК в крови матери и сроками родоразрешения [20]. Установлена взаимосвязь высокого уровня сэ-ДНК в крови женщин с развитием спонтанных преждевременных родов. Это наблюдение требует дальнейшего исследования для понимания патогенетических механизмов, лежащих в основе данного состояния.

Кроме того, сэ-ДНК и общая ДНК матери были предложены в качестве потенциальных маркеров для неинвазивной пренатальной диагностики во время беременности. Тем не менее, соотношение изменений уровня сэ-ДНК и материнской ДНК при самопроизвольном выкидыше плодом с анеуплоидией еще не до конца изучено. Так в Корее было проведено исследование, где определялся уровень свободной эмбриональной ДНК и общей ДНК в кровотоке женщин с самопроизвольным выкидышем плодом с анеуплоидией [21]. В исследование вошли 268 женщин в первом триместре беременности, из них 41 женщина с самопроизвольным выкидышем и нормальным кариотипом плода, 26 женщин с самопроизвольным выкидышем плодом с анеуплоидией и 201 женщина контрольной группы. Неметилированный PDE9A ген был использован для измерения уровня свободной эмбриональной ДНК в материнской плазме. Уровень свободной эмбриональной ДНК и общей ДНК был значительно выше у женщин с самопроизвольным выкидышем, как с нормальным кариотипом плода, так и с анеуплоидиями, по сравнению с контрольной группой (р<0,001 в обеих группах). В результате был сделан вывод, что высокий уровень сэ-ДНК и общей ДНК матери был выявлен у женщин с самопроизвольным выкидышем плодом с анеуплоидией. Эти результаты показывают, что сэ-ДНК может быть полезным маркером для прогнозирования самопроизвольного выкидыша, как в случаях анеуплоидии, так и при нормальном кариотипе плода.

В настоящее время неясно, достаточной ли точностью обладают методы неинвазивной пренатальной диагностики для того чтобы заменить кариотипирование. Однако определение свободных нуклеиновых кислот может быть использовано для скрининга и определения риска у всех беременных независимо от возраста до постановки окончательного диагноза как самостоятельный метод, так и в дополнение к существующим методам.

Общепринятая пренатальная диагностика у женщин без отягощенного семейного анамнеза состоит из двух шагов: оценка степени риска у всех беременных и последующая пренатальная диагностика в группе высокого риска. «Золотым стандартом» диагностики любой анеуплоидии является получение клеток плодового происхождения путем хориоцентеза или амниоцентеза с последующим кариотипированием и реже молекулярными технологиями. Методы неинвазивной пренатальной диагностики до сих пор не могут быть альтернативой или заменить инвазивные процедуры, особенно в случаях мозаицизма, когда число анеуплоидных клеток уступает нормальным. Авторы полагают, что определение сэ-ДНК может заменить или усовершенствовать существующие скрининговые тесты. Наиболее часто встречающейся анеуплоидией является трисомия по 21-й хромосоме (синдром Дауна). Частота синдрома Дауна строго коррелирует с возрастом матери и составляет от 0,07% в возрасте 20 лет и 1% в возрасте 40 лет.

Существующий протокол скрининга на трисомию по 21-й хромосоме включает определение белковых маркеров материнского происхождения, ассоциированных с синдромом Дауна в совокупности с данными ультразвукового исследования. Степень риска вычисляется для каждой беременности с учетом возраста матери, что повышает уровень определения до 85%, с ложноположительными результатами, равными 5%.

Другие анеуплоидии также могут быть диагностированы по сэ-ДНК в материнской плазме – синдром Эдвардса (трисомия 18), синдром Патау (трисомия 13), числовые изменения половых хромосом – синдром Тернера (Х0), синдром Клайнфельтера (ХХY) и др. Главным различимым фактором при диагностике анеуплоидий является снижение или увеличение специфического хромосомного материала. В целях неинвазивной пренатальной диагностики важно не только определить количество хромосомного материала, но и соотнести его с определенной хромосомой. В настоящее время исследователи не пришли к единому мнению относительно наилучшего метода неинвазивной пренатальной диагностики анеуплоидий, обсуждение различных методик продолжается.

Хотя некоторые исследователи полагают, что при анеуплоидиях происходит 2–3-кратное повышение уровня как сэ-ДНК, так и общего уровня свободной ДНК (материнской и эмбриональной), это утверждение подтверждается не во всех работах. Последние исследования показали отсутствие достоверных различий в уровнях сэ-ДНК и общего уровня свободной ДНК при трисомиях по 21-й, 13-й и 18-й хромосомам. Уровень свободной ДНК колеблется в широких пределах, во многом зависит от характера течения беременности, в связи с чем более перспективными являются определение и количественная оценка специфических хромосомных маркеров, которые обязательно меняются при анеуплоидиях.

Требуются дальнейшие исследования в данной области для определения возможностей клинического применения описанных методов как у беременных женщин групп риска, так и в качестве скрининговых методик.

Список литературы

  1. Lo Y.M., Corbetta N., Chamberlain P.F., Rai V., Sargent I.L., Redman C.W., Wainscoat J.S. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet. 1997; 350(9076): 485–7.
  2. Zhong X.Y., Laivuori H., Livingston J.C., Ylikorkala O., Sibai B.M., Holzgreve W., Hahn S. Elevation of both maternal and fetal extracellular circulating deoxyribonucleic acid concentrations in the plasma of pregnant women with preeclampsia. Am. J. Obstet. Gynecol. 2001; 184(3): 414–9.
  3. Hill M., Taffinder S., Chitty L.S., Morris S. Incremental cost of non-invasive prenatal diagnosis versus invasive prenatal diagnosis of fetal sex in England. Prenat. Diagn. 2011; 31(3): 276–73.
  4. Ishihara N., Matsuo H., Murakoshi H., Laoag-Fernandez J.B., Samoto T., Maruo T. Increased apoptosis in the syncytiotrophoblast in human term placentas complicated by either preeclampsiaor intrauterine growth retardation. Am. J. Obstet. Gynecol. 2002; 186(1): 158–66.
  5. Leung T.N., Lau T.K., Chung T.K. Thalassaemia screening in pregnancy. Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 2005; 17(2): 129–34.
  6. Masuzaki H., Miura K., Yoshiura K.I., Yoshimura S., Niikawa N., Ishimaru T. Detection of cell free placental DNA in maternal plasma: direct evidence from three cases of confined placental mosaicism. J. Med. Genet. 2004; 41(4): 289–92.
  7. Costa J.M., Benachi A., Gautier E. New strategy for prenatal diagnosis of X-linked disorders. N. Engl. J. Med. 2002; 346(19): 1502.
  8. Hall A., Bostanci A., Wright C.F. Non-invasive prenatal diagnosis using cell-free fetal DNA technology: applications and implications. Public Health Genomics. 2010; 13(4): 246–55.
  9. Chiu R.W., Lau T.K., Cheung P.T., Gong Z.Q., Leung T.N., Lo Y.M. Noninvasive prenatal exclusion of congenital adrenal hyperplasia by maternal plasma analysis: a feasibility study. Clin. Chem. 2002; 48(5): 778–80.
  10. Wright C.F., Burton H. The use of cell-free fetal nucleic acids in maternal blood for non-invasive prenatal diagnosis. Hum. Reprod. Update. 2009; 15(1): 139–51.
  11. Nygren A.O., Dean J., Jensen T.J., Kruse S., Kwong W., van den Boom D., Ehrich M. Quantification of fetal DNA by use of methylation-based DNA discrimination. Clin. Chem. 2010; 56(10): 1627–35.
  12. Zhao F., Wang J., Liu R., Yang J., Cui K., Wu Y. et al. Quantification and application of the placental epigenetic signature of the RASSF1A gene in maternal plasma. Prenat. Diagn. 2010; 30(8): 778–82.
  13. Pertl B., Sekizawa A., Samura O., Orescovic I., Rahaim P.T., Bianchi D.W. Detection of male and female fetal DNA in maternal plasma by multiplex fluorescent polymerase chain reaction amplification of short tandem repeats. Hum. Genet. 2000; 106(1): 45–9.
  14. Lo Y.M., Leung T.N., Tein M.S., Sargent I.L., Zhang J., Lau T.K. et al. Quantitative abnormalities of fetal DNA in maternal serum in preeclampsia. Clin. Chem. 1999; 45(2): 184–8.
  15. Rusterholz C., Messerli M., Hoesli I., Hahn S. Placental microparticles, DNA, and RNA in preeclampsia. Hypertens. Pregnancy. 2011; 30: 364–75.
  16. Farina A., LeShane E.S., Romero R., Gomez R., Chaiworapongsa T., Rizzo N., Bianchi D.W. High levels of fetal cell-free DNA in maternal serum: a risk factor for spontaneous preterm delivery. Am. J. Obstet. Gynecol. 2005; 193(2): 421–5.
  17. Sekizawa A., Jimbo M., Saito H., Iwasaki M., Sugito Y., Yukimoto Y. et al. Increased cell-free fetal DNA in plasma of two women with invasive placenta. Clin. Chem. 2002; 48(2): 353–4.
  18. Al Nakib M., Desbrière R., Bonello N., Bretelle F., Boubli L., Gabert J., Levy-Mozziconacci A. Total and fetal cell-free DNA analysis in maternal blood as markers of placental insufficiency in intrauterine growth restriction. Fetal Diagn. Ther. 2009; 26(1): 24–8.
  19. Alberry M.S., Maddocks D.G., Hadi M.A., Metawi H., Hunt L.P., Abdel-Fattah S.A. et al. Quantification of cell free fetal DNA in maternal plasma in normal pregnancies and in pregnancies with placental dysfunction. Am. J. Obstet. Gynecol. 2009; 200: 98. e1–6.
  20. Jakobsen T.R., Clausen F.B., Rode L., Dziegiel M.H., Tabor A. High levels of fetal DNA are associated with increased risk of spontaneous preterm delivery. Prenat. Diagn. 2012; 32(9): 840–5.
  21. Lim J.H., Kim M.H., Han Y.J., Lee da E., Park S.Y., Han J.Y. et al. Cell-free fetal DNA and cell-free total DNA levels in spontaneous abortion with fetal chromosomal aneuploidy. PLoS One. 2013; 8(2): e56787.

Об авторах / Для корреспонденции

Парсаданян Нанэ Геворковна, аспирант, 2-е отделение акушерское патологии беременности ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (926) 330-42-41. E-mail: nnnpars@mail.ru
Шубина Екатерина Сергеевна, лаборант-исследователь лаборатории молекулярно-генетических методов, ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (926) 721-87-17. E-mail: e_shubina@oparina4.ru
Трофимов Дмитрий Юрьевич, д.б.н., зав. лабораторией молекулярно-генетических методов, ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-49-51. E-mail: d_trofimov@oparina4.ru
Тетруашвили Нана Картлосовна, д.м.н., профессор, зав. 2-м отделением акушерским патологии беременности ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-14-77. E-mail: tetrauly@mail.ru

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь