Видовой состав лактобактерий при неспецифических вагинитах и бактериальном вагинозе и его влияние на локальный иммунитет

01.01.2014
2655

ФГБУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. академика В.И. Кулакова Минздрава России, Москва

Цель исследования. Изучение видового и количественного состава лактобактерий у женщин с неспецифическими вагинитами и бактериальным вагинозом и оценка его влияния на состояние локального иммунитета влагалища.
Материал и методы. Методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени обследованы 377 женщин репродуктивного возраста: 157 пациенток с неспецифическим вагинитом, 46 с бактериальным вагинозом и 174 условно здоровые женщины.
Результаты. Показано, что в составе лактофлоры наиболее часто встречаются 4 вида лактобактерий: L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri. В контрольной группе в составе лактофлоры преобладает L. crispatus. Неспецифический вагинит сопровождается повышением доли L. iners, бактериальный вагиноз – L. gasseri в составе лактофлоры. Доминирование L. iners оказывает влияние на локальный иммунитет.
Заключение. Повышенное количество L. iners и L. gasseri в составе лактофлоры ассоциировано с вагинитами различной этиологии и бактериальным вагинозом.

Работа частично поддержана Государственным контрактом Министерства образования и науки РФ №16.522.12.2009 от 29.09.2011.

В состав микрофлоры влагалища входит свыше 400 видов микроорганизмов, включая условно-патогенные [1]. В норме преобладают бактерии рода Lactobacillus. Доминирование лактобактерий в составе микробиоценоза влагалища определяется насыщенностью организма женщин эстрогенами, которые индуцируют накопление в вагинальном эпителии гликогена, являющегося идеальным субстратом для роста лактобактерий. Лактобактерии расщепляют гликоген с образованием молочной кислоты, которая поддерживает рН среды на низком уровне (3,8–4,5), что ограничивает рост условно-патогенных микроорганизмов (УПМ). Защитные механизмы лактобактерий обусловлены также выработкой бактериоцинов и перекиси водорода [2]. Исследования последних лет показали, что лактобактерии выделяют во внеклеточную среду экзополисахариды, способствующие их адгезии на слизистом эпителии, обеспечивающие стабильность мукозального слоя слизистых оболочек и резистентность к УПМ [3].

Описано около 120 видов лактобактерий, входящих в состав микробиоценозов, из них только 20 видов колонизируют слизистую влагалища [2]. При этом чаще всего основу микробиоты влагалища здоровых женщин репродуктивного возраста составляют 4 вида: Lactobacillus crispatus, L. iners, L. gasseri и L. jensenii [4]. Несмотря на то, что L. iners в норме присутствует в составе микробиоты влагалища достаточно часто, ее протективное значение остается спорным, а некоторые авторы даже полагают, что L. iners играет роль в патогенезе бактериального вагиноза (БВ) [4].

Цель настоящего исследования состояла в изучении видового и количественного состава лактобактерий у женщин с неспецифическими вагинитами (НВ) и БВ и оценка его влияния на состояние локального иммунитета влагалища.

Материал и методы исследования

Проведено клинико-лабораторное обследование 377 женщин в возрасте от 19 до 45 лет (средний возраст составил 29±5,4 года), которое включало сбор анамнестических данных, жалоб пациенток, осмотр вульвы, влагалища и шейки матки в зеркалах, бимануальное гинекологическое исследование. В качестве специальных методов исследования использовали микроскопию мазков, окрашенных по Граму, культуральное исследование, исследование микрофлоры влагалища методом количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени и анализ уровня экспрессии 11 генов, участвующих в иммунном ответе. Материалом для лабораторного исследования служили вагинальное отделяемое и клетки соскобов слизистой влагалища.

Пациентки были разделены на три группы:

I группа – пациентки с признаками вагинита (n=157). В I группе пациенток выявлено наличие воспалительной реакции со стороны слизистой влагалища и шейки матки, количество лейкоцитов в мазке по Граму было более 10 в поле зрения. Пациентки предъявляли жалобы на обильные выделения из половых путей (79,5%), зуд (40,4%), жжение во влагалище (32,9%), неприятный запах из половых путей (13,7%), диспареунию (9,9%), дизурические расстройства (3,7%).

II группа – женщины с БВ (n=46). Диагноз поставлен на основании трех из четырех критериев Амсела: наличие патологических выделений, рН>4,5, положительный аминный тест, а также выявление «ключевых клеток» в мазках, окрашенных по Граму (при количестве лейкоцитов в мазке менее 10 в поле зрения). Пациентки II группы предъявляли жалобы на обильные выделения (60,9%) и наличие неприятного запаха из половых путей у каждой 3-й пациентки (30,4%). Вместе с тем зуд (8,7%, р=5,8х10-5) и жжение (6,5%, р=0,0004) во влагалище встречались реже, чем в I группе пациенток. Диспареуния и дизурические расстройства отмечены в 2,2% и 0% случаев соответственно. У 30,9% БВ протекал бессимптомно.

III группа – условно здоровые женщины, которые не предъявляли жалоб (n=174). Признаков воспалительных заболеваний половых путей при гинекологическом обследовании выявлено не было. Однако по результатам лабораторного исследования у 25 пациенток данной группы имело место наличие в мазках Ureaplasma spp. в количестве более 4lg/мл, а у 29 – кандиданосительство. Эти женщины были исключены из группы условно здоровых женщин при формировании контрольной группы (n=120).

При количественной оценке биоценоза влагалища учитывали: общее количество бактерий, количество Lactobacillus spp. и 14 основных групп микроорганизмов, представляющих условно-патогенную флору, включая факультативно-анаэробные, облигатно-анаэробные микроорганизмы, а также Candida spp., Ureaplasma spp., Mycoplasma hominis (Фемофлор 16, ДНК-Технология, Россия).

Под нормоценозом понимали вариант биоценоза, при котором доля нормофлоры (Lactobacillus spp.) в его составе была более 80% по отношению к общему количеству бактерий. Относительный нормоценоз расценивали как вариант биоценоза, при котором доля нормофлоры в его составе была более 80%, но количество Ureaplasma spp., M. hominis могло быть более 104 гэ/мл. Под анаэробным и аэробным дисбиозом понимали дисбаланс биоты, обусловленный одним или несколькими УПМ соответственно в количестве более 20% по отношению к общему количеству бактерий. Смешанный дисбиоз – дисбаланс, вызванный сочетанием бактериальной биоты в сочетании с Candida spp. Количество Candida spp. более 103 гэ/мл расценивали как положительный результат: в зависимости от жалоб пациентки, результатов клинического осмотра и микроскопии мазков как вульвовагинальный кандидоз (ВВК) либо как кандиданосительство.

По структуре биоценоза в группе женщин с НВ различали несколько вариантов состояния биоценоза: ВВК (n=37), аэробный дисбиоз (n=14), облигатно-анаэробный дисбиоз (n=23), аэробно-анаэробный дисбиоз (n=12), смешанный дисбиоз (n=25) и нормоценоз (n=39). У 7 пациенток выявлена Ureaplasma spp. более 4lg/мл, которая рассматривалась как возможный этиологический агент вагинита.

В группе женщин с БВ во всех случаях выявлен облигатно-анаэробный дисбиоз. В составе микробиоценоза влагалища у всех женщин III группы доминировали лактобактерии по отношению к общей бактериальной массе.

Типирование лактобактерий проводили с помощью комплекта реагентов (ДНК-Технология, Россия). Оценивали количество 6 основных видов лактобактерий влагалища: L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri, L. jonsonii, L. vaginalis и 5 биотехнологических видов: L. acidiphilis, L. casei/ L. rhamnosus, L. plantarum, L. fermentum.

Профиль мРНК генов цитокинов (интерлейкинов (IL)-1В, IL-8, IL-10, IL-12А, IL-18, трансформирующего фактора роста (TGF)-β1), транскрипционного фактора GATA3, толл-подобных-рецепторов (TLR4) и других маркеров клеток иммунной системы (CD45, CD68, CD69) в вагинальных мазках исследовали методом количественной ПЦР с обратной транскрипцией. Нормировка полученных результатов осуществялась методом сравнения индикаторных циклов (метод Δ∆Cq) по трем референсным генам TBP, B2M, GUSB. Медианы значений уровней экспрессии мРНК (Ме) в контрольной группе женщин с доминированием L. crispatus были приняты за 1, а значения Ме в исследуемых группах показывало, во сколько раз уровень экспрессии гена выше или ниже по отношению к контрольной группе.

Достоверность межгрупповых различий количественных показателей определяли с помощью критерия Манна–Уитни, качественных показателей –χ2-критерия с поправкой Йетса для малых выборок.

Результаты исследования

При исследовании лактобактерий было выявлено, что основными преобладающими видами в составе лактофлоры (более 50 % по отношению к суммарному количеству лактобактерий) были только 4 вида лактобактерий: L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri (рис. 1 см. на вклейке). В зависимости от группы исследования доля образцов с L. crispatus в качестве основного вида в составе лактофлоры составила от 17 до 52%, L. iners – 27–48%, L. gasseri – 3–30%, L. jensenii – 0–16%, других видов – до 5%. Необходимо отметить, что в контрольной группе лактобактерии были доминирующим видом, составляющим основную часть бактериальной массы (не менее 80%). В то время как при НВ и БВ количество лактобактерий по отношению к общей бактериальной массе было сниженным (менее 80%) вплоть до полного отсутствия, а количество УПМ превышало 20%. Поэтому учитывали долю отдельных видов лактобактерий в составе лактофлоры.

Преобладание L. crispatus в составе лактофлоры ассоциировано с нормальным состоянием микробиоты влагалища. Преобладание L. crispatus составило 50% и было статистически более значимым в контрольной группе, чем в группе женщин с НВ – 17% (OR=5 (2,9–8,6), p=2,5×10-9) и БВ – 17% (OR=4.8 (2–11), p=1,3×10-4).

Напротив, доля образцов с преобладанием L. iners в составе лактофлоры была выше при дисбиотических процессах и составила 48% при НВ (OR=4,4 (1,9–9,9), p=2,2×10-4), 38% – при кандиданосительстве (OR=2,9 (1–8,5), p=0,046), 48% – при относительном нормоценозе (OR=5 (1,5–13,1), p=6,2×10-3) в сравнении с контрольной группой (27%). Аналогичная тенденция была получена и для группы женщин с БВ (р=0,09).

Кроме того, с неблагоприятным состоянием микробиоты, вероятно, ассоциировано и преобладание в составе лактофлоры L. gasseri. В группе женщин с БВ достоверно чаще отмечено наличие L. gasseri как основного вида в составе нормофлоры – 30% по сравнению с контрольной группой – 8% (OR=5,4 (2,1–13,6), p=1,3×10-4). Аналогичная тенденция получена и для группы с НВ (р=0,08). При НВ и БВ выявлены образцы без лактобактерий. Их доля составила 4% при НВ и 9% при БВ.

При исследовании экспрессионного профиля было установлено, что НВ сопровождается достоверным повышением уровня экспрессии мРНК IL-1В в 4,1 раза (р=1,4×10-9), IL-8 в 6,3 (р=5,8×10-10), IL-10 в 7 (р=1,9×10-14), CD69 в 4,6 (р=5×10-9), CD45 в 3 (р=7×10-9), TLR4 в 4,5 (р=1,1×10-12) и снижением IL-12А в 3,8 (р=3,3×10-8), CD68 в 4 (р=4,2×10-15), TGF-β1 в 3,1 (р=7,9×10-9), IL-18 в 15,6 (р=1,4×10-18), GATA3 в 11,5 раза (р=1,5×10-18) по сравнению с образцами контрольной группы, в которых доминирует L.crispatus (рис. 2).

Аналогичные изменения экспрессионного профиля были выявлены и при БВ: повышение уровня экспрессии мРНК IL-1В в 2,6 раза (р=0,02), IL-8 в 3,7 (р=0,002), IL-10 в 3,8 (р=10-5), CD69 в 2,1 (р=0,005), CD45 в 1,8 (р=0,017), TLR4 в 1,6 раза (р=0,032) и снижением IL-12А в 1,5 (р=0,033), CD68 в 2,2 (р=7,2×10-5), TGF-β1 в 2 (р=0,004), IL-18 в 6,5 (р=7,2×10-10), GATA3 в 5,7 раза (р=8,9×10-7) по сравнению с образцами контрольной группы, в которых доминирует L. crispatus.

При исследовании образцов контрольной группы в случаях доминирования L. iners был достоверно повышен уровень экспрессии мРНК генов IL-8 в 1,7 (p=0,026), TLR4 в 2 (p=0,033), IL-10 в 3,8 (p=0,01), CD69 в 2,5 (p=0,005), CD45 в 1,7 (p=0,049) раза и снижен IL-18 в 1,7 (p=0,005) раза по сравнению с образцами, в которых доминирует L. crispatus. Полученные данные согласуются с лучшей протекторной функцией L. crispatus.

Обсуждение

Было выявлено, что в составе нормофлоры наиболее часто встречаются только 4 вида: L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri. Полученные результаты о преимущественном распространении 4 видов лактобактерий согласуются с литературными данными [4].

По результатам нашего исследования частоты распространения и преимущественного количественного преобладания в составе нормофлоры различных видов лактобактерий в контрольной группе (рис. 1 см. на вклейке) приблизительно соответствуют данным Дж. Равель [5] для белой популяции женщин. Равель, исследовав около 400 образцов влагалищных мазков женщин северо-американского континента, установил, что L. crispatus доминировала в 45,4% случаев, L. iners – в 26,8%, L. gasseri – в 8,2%, L. jensenii – в 9,3% у белых женщин.

Согласно полученным результатам, преобладание L. crispatus в составе лактофлоры ассоциировано с нормальным состоянием микробиоты влагалища. Полученные результаты согласуются с результатами, приведенными в ряде публикаций. Защитная роль лактобактерий обусловлена по меньшей мере двумя факторами – выработкой молочной кислоты и перекиси водорода. В работе Дж. Равель [5] показана зависимость рН-среды от типа микробиоты. Наиболее кислая среда (рН=4,0±0,3) во влагалищном отделяемом была определена при доминировании L. crispatus, рН=4,4±0,6 – при доминировании L. iners. M.A. Antonio и соавт. отмечают, что большинство штаммов L. crispatus, выделенных из влагалища и кишечника, вырабатывают перекись водорода, в то время как большинство штаммов L. iners ее не cинтезируют [6]. Кроме того, R. Rampersaud выделил и охарактеризовал токсин инеролизин, выделяемый L. iners, аналогичный интермедилизину Streptococcus intermedius и вагинолизину Gardnerella vaginalis, роль которых в патогенезе дисбиотических процессов доказана [7].

Показано, что с неблагоприятным состоянием микробиоты, вероятно, ассоциировано и преобладание в составе нормофлоры L. gasseri. Согласно данным литературы большинство штаммов L. jensenii, L. gasseri являются хорошими продуцентами перекиси водорола [8]. Однако, по данным Дж. Равель, при доминировании L. jensenii и L. gasseri влагалищная среда менее кислая (соответственно рН=4,7±0,4 и рН=5,0±0,7), чем при доминировании L. crispatus (рН=4,0±0,3). Verstraelen и соавт. [9], описывая состав микрофлоры влагалища беременных женщин (9 и 32 недели гестации), пришли к заключению, что доминирование L. crispatus обеспечивает стабильное состояние экосистемы. Микрофлора, включающая L. jensenii, вызывает промежуточное состояние стабильности, а при доминировании L. iners и L. gasseri состояние системы наименее стабильно.

Изменения в транскрипционном профиле некоторых генов, ассоциированные с L. iners, аналогичны изменениям, характерным для НВ и БВ, хотя и существенно менее выраженные. Таким образом, преобладание в составе нормофлоры L. iners создает легкий провоспалительный фон.

Заключение

В составе нормофлоры наиболее часто встречаются 4 вида лактобактерий: L. crispatus, L. iners, L. jensenii, L. gasseri. В контрольной группе в составе лактофлоры преобладает L. crispatus. Воспалительные заболевания нижних отделов репродуктивной системы женщин и БВ сопровождаются повышением доли L. iners и L. gasseri в составе лактофлоры. В контрольной группе увеличение доли L. iners в составе лактофлоры оказывает влияние на локальный иммунитет и сопровождается достоверным повышением IL-8, TLR4, IL-10, CD69, CD45 и снижением IL-18 по сравнению с образцами, в которых основным видом лактобактерий является L. crispatus. Повышенную долю L. crispatus в составе лактофлоры можно расценивать как благоприятный прогностический признак при оценке состояния микробиоценоза влагалища. Повышенное количество L. iners и L. gasseri в составе лактофлоры ассоциировано с вагинитами различной этиологии и БВ.

Список литературы

  1. Орлова В.С., Набережнев Ю.И. Нормоценоз влагалища у женщин репродуктивного возраста, механизмы его регуляции и дисбиотические варианты. Российский вестник акушера-гинеколога. 2007; 4: 36–9.
  2. Lamont R.F., Sobel J.D., Akins R.A., Hassan S.S., Chaiworapongsa T., Kusanovic J.P., Romero R. The vaginal microbiome: new information about genital tract flora using molecular based techniques. Br. J. Obstet. Gynaecol. 2011;118(5): 533–49.
  3. Foster L.M., Tompkins T.A., Dahl W.J. A comprehensive post-market review of studies on a probiotic product containing Lactobacillus helveticus R0052 and Lactobacillus rhamnosus R0011. Benef. Microbes. 2011; 2(4): 319–34.
  4. Yan D.H., Lü Z., Su J.R. Comparison of main Lactobacillus species between healthy women and women with bacterial vaginosis. Chin. Med. J. (Engl.). 2009; 122(22): 2748–51.
  5. Ravel J., Gajer P., Abdo Z., Schneider G.M., Koenig S.S., McCulle S.L. et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2011; 108(Suppl. 1): 4680–7.
  6. Antonio M.A., Rabe L.K., Hillier S.L. Colonization of the rectum by Lactobacillus species and decreased risk of bacterial vaginosis. J. Infect. Dis. 2005; 192: 394–8.
  7. Rampersaud R., Planet P.J., Randis T.M., Kulkarni R., Aguilar J.L., Lehrer R.I., Ratner A.J. Inerolysin, a cholesterol-dependent cytolysin produced by Lactobacillus iners. J. Bacteriol. 2011; 193(5): 1034–41.
  8. Vallor A.C., Antonio M.A.D., Hawes S.E., Hillier S.L. Factors associated with acquisition of, or persistent colonization by, vaginal lactobacilli: role of hydrogen peroxide production. J. Infect. Dis. 2001; 184(11): 1431–6.
  9. Verstraelen H., Verhelst R., Claeys G., De Backer E., Temmerman M., Vaneechoutte M. Longitudinal analysis of the vaginal microflora in pregnancy suggests that L. crispatus promotes the stability of the normal vaginal microflora and that L. gasseri and/or L. iners are more conducive to the occurrence of abnormal vaginal microflora. BMC Microbiol. 2009; 9: 116.

 

Об авторах / Для корреспонденции

Бурменская Ольга Владимировна, кандидат биологических наук, научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-22-92. E-mail: bourmenska@mail.ru
Байрамова Гюльдана Рауфовна, кандидат медицинских наук, заведующая по клинической работе научно-поликлинического отделения ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-18-66. E-mail: bayramova@mail.ru
Непша Оксана Сергеевна, кандидат биологических наук, младший научный сотрудник лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-2292. E-mail: o_nepsha@oparina4.ru
Трофимов Дмитрий Юрьевич, доктор биологических наук, заведующий лабораторией молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-4951. E-mail: d_trofimov@oparina4.ru
Муравьева Вера Васильевна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории микробиологии ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-25-33. E-mail: v_muravieva@oparina4.ru
Абакарова Патимат Рапиевна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник поликлинического отделения ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-30-44. E-mail: abakarova2002@mail.ru
Стрельченко Дарья Александровна, ординатор ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-18-66. E-mail: str_3812@mail.ru
Кряжева Варвара Сергеевна, ординатор ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-18-66. E-mail: salvaje@mail.ru
Сухих Геннадий Тихонович, академик РАМН, профессор, директор ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Адрес: 117997, Россия, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4. Телефон: 8 (495) 438-18-00. E-mail: g_sukhikh@oparina4.ru

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь