Влияние экзогенного пептида апелина-12 на восстановление функции и метаболизма изолированного сердца крысы после ишемии

Апелин 12 (А 12) получен методом автоматического твердофазного синтеза пептидов, очищен с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе; его гомогенность и структура подтверждены с помощью ВЭЖХ, 1Н ЯМР спектроскопии и масс спектроскопии. Действие А 12 изучено на изолированном работающем сердце крысы, перфузируемом раствором Кребса (РК) с 11 мМ глюкозой, которое подвергали 35 минутной глобальной ишемии и 30 минутной реперфузии. Инфузию РК, содержащего А 12 (35, 70, 140, 280 или 560 мкМ), проводили перед ишемией (А 12 И) или в начале реперфузии (А 12 Р); в контроле вводили РК. Введение А 12 улучшало восстановление коронарного потока, сократительной и насосной функции сердца при реперфузии, причем в наибольшей степени в группе А 12 И. Так, после инфузии 140 мкМ А 12 коронарный поток, показатель интенсивности сократительной функции (Рразв. ? ЧСС) и минутный объем в конце реперфузии в группе А 12 И составляли 92±5, 81±5 и 77±5% от исходных значений, соответственно в группе А 12 Р — 83±6, 61±5 и 52±5% по сравнению с 76±2, 42±2 и 32±2% в контроле. В обеих группах А 12 уменьшалась ишемическая и реперфузионная контрактура. Лучшее функциональное восстановление сердец в группе А 12 И сопровождалось снижением выведения в перфузат активности лактатдегидрогеназы на стадии ранней реперфузии (на 36±5% по сравнению с контролем; р<0,05). Введение 140 мкМ А 12 перед ишемией достоверно увеличивало содержание АТФ и снижало накопление АМФ в миокарде к окончанию реперфузии. В результате общий фонд адениннуклеотидов и энергетический потенциал в постишемических кардиомиоцитах были восстановлены до 81±5 и 86±3% от исходных, соответственно, по сравнению с 66±3% в контроле (р<0,05). В конце реперфузии cодержание лактата и отношение лактат/пируват в ткани сердца достоверно не отличались от таковых до ишемии и были в 5 раз ниже, чем в контроле, что указывало на восстановление аэробной утилизации глюкозы. Таким образом, меньшие повреждения функции сердца и клеточных мембран под влиянием A 12 могли быть обусловлены лучшим сохранением энергетического обмена в ишемизированном сердце. Обсуждены кардиопротекторные механизмы действия апелина.

В условиях ишемии и последующей реперфузии в миокарде усиливается образование ряда присущих организму факторов — адипокинов, цитокинов и вазоактивных пептидов, опосредующих механизмы адаптации клеток к такому повреждению [1—3]. К их числу относится адипокин апелин — пептид, состоящий из 77 аминокислот и являющийся лигандом, сопряженного с Gi-белком APJ-рецептора [4, 5]. Апелин активно экспрессируется различными тканями, включая эндотелиальные и гладкие
мышечные клетки коронарных сосудов и кардиомиоциты [4]. Активация системы апелин—APJ-рецептор вызывает гипотензивный и положительный инотропный эффект [4, 6, 7], что указывает на ее важную роль в регуляции сердечно-сосудистого гомеостаза. В последние годы обнаружено, что 2 более коротких фрагмента пептида — апелин-36 и апелин-13 — обладают кардиопротекторной активностью и способны защищать сердце от ишемического и реперфузионного стресса. Под действием этих пептидов уменьшались размеры инфаркта и улучшалось восстановление сократительной функции изолированного перфузируемого сердца мышей и крыс после тотальной или регионарной ишемии [8—10]. Это сочеталось с увеличением активности в миокарде супероксид-дисмутазы, уменьшением образования продукта перекисного окисления липидов — малонового диальдегида — и меньшими повреждениями сарколеммы ишемизированных кардиомиоцитов [10]. В культуре неонатальных и зрелых кардиомиоцитов, подвергнутых ишемии и реоксигенации, апелин-13 усиливал экспрессию NO-cинтазы, образование NO и одновременно подавлял продукцию суперокид-аниона [10]. Получены экспериментальные подтверждения ингибирования апелином-13, и в меньшей степени апелином-36, открытия митохондриальной поры и апоптоза в кардиомиоцитах крыс при моделировании окигенационного стресса [8, 10]. Ряд авторов высказали гипотезу о том, что более физиологически активный апелин-13 инициирует механизмы запрограммированного клеточного выживания, которые запускаются каскадами реперфузионных киназ [11, 12]. Гипотеза была подтверждена отменой влияния апелина-13 на открытие митохондриальной поры и гибель кардиомиоцитов в присутствии ингибиторов фосфатидилинозитол-3-киназы, Akt-киназы (PI3K-Akt) и митоген-акивируемой p44/42 киназы [8, 10, 11].
Эти данные свидетельствуют о возможности существенного улучшения метаболического состояния постишемического сердца под влиянием экзогенного апелина.

Целью настоящей работы было изучение кардиозащитных свойств апелина-12 — фрагмента пептида, полностью идентичного таковому у человека, — на модели изолированного работающего сердца крысы, подвергнутого тотальной ишемии. Предполагалось сопоставить влияние апелина-12 при его
введении до периода ишемии и в начале реперфузии на восстановление функции сердца, а также оценить его действие на метаболизм миокарда и повреждения клеточных мембран.

Материал и методы

Получение апелина-12 H-Arg-Pro-Arg-Leu-Ser-His-Lys-Gly-Pro-Met-Pro-Phe-OH. А-12 был получен путем автоматического твердофазного синтеза на пептидном синтезаторе фирмы Applied Biosystems 431A (Германия) с использованием Fmoc-методологии на полимере Ванга по стандартным программам. Твердофазный синтез проводили исходя из 0,25 ммоль коммерческого Fmoc-Phe-полимера (Bachem, Швейцария), путем последовательного удлинения пептидной цепи с С-конца. На первой стадии синтеза с целью предотвращения побочной реакции образования дикетопиперозина из пролинсодержащего дипептидилполимера присоединяли дипептидный блок Fmoc-Met-Pro-OH. После
этого цепь наращивали по одной аминокислоте. Для создания амидной связи применяли карбодиимидный метод. Конечный продукт отщепляли от полимерного носителя одновременно
с удалением защитных групп боковых функций аминокислот действием трифторуксусной кислоты со скавенджерами. Пептид был очищен с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) до 98% чистоты и охарактеризован с помощью 1Н-ЯМР-спектроскопии и MALDI-масс-спектрометрии (m/z 1423,5; расчетная молекулярная масса 1422,7). В работе использованы производные аминокислот, реагенты и растворители фирм Bachem и Fluka (Швейцария).

Перфузия изолированного сердца крысы. Опыты выполнены на сердце крыс-самцов линии Wistar (290—340 г). У наркотизированных уретаном (внутрибрюшинно 1,25 мг на г массы тела) животных извлекали сердце и перфузировали ретроградно в течение 15—20 мин раствором Кребса (РК)
с 11 мМ глюкозой, насыщенным карбогеном (95% О2±5% СО2) рН 7,4±0,1 при температуре 37 °С, при постоянном перфузионном давлении 60 мм рт.ст. После этого сердца перфузировали антеградно по Нийли при постоянном давлении наполнения левого предсердия 15 мм рт.ст. и среднем перфузионном давлении в аорте 60 мм рт.ст. [13].

Давление в аорте и левом желудочке регистрировали при помощи тензометрических датчиков Р50, монитора SP1405 и регистратора SP2010 (Gould Statham, США). Показателем интенсивности сократительной функции (ИСФ) левого желудочка служило произведение частоты сокращений сердца на развиваемое давление (разнос...

Писаренко О.И., Шульженко В.С., Пелогейкина Ю.А., Студнева И.М., Кхатри Д.Н., Беспалова Ж.Д., Азьмуко А.А., Сидорова М.В., Палькеева М.Е.