Влияние контролируемой механической микровибрации на метаболомный профиль сред культивирования эмбрионов человека пятых суток развития

Цель. Оценить влияние контролируемой механической микровибрации (КММВ) на профиль метаболитов в средах культивирования эмбрионов человека на 5-е сутки развития.
Материалы и методы. В ходе проспективного исследования были проанализированы 62 образца сред культивирования (СК) эмбрионов 5-х суток развития, полученные от 44 пациенток в рамках программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). В условиях КММВ культивировали 20 эмбрионов, в стандартных условиях – 42 эмбриона. При культивировании в условиях механической микровибрации инкубатор помещали на платформу ArisTT180-s (K&S Advanced Systems Ltd, Израиль) в режиме активной вибрации с частотой 40 Гц в течение 30 секунд с интервалом покоя 30 минут. Экстракция метаболитов проводилась путем добавления 3 объемов метанола с последующим центрифугированием. Хроматографическое разделение проводилось в обратнофазной хроматографической системе на колонке Atlantis T3 C18 (Waters, USA). Детекция метаболитов проводилась на гибридном квадруполь-времяпролетном масс-спектрометре Bruker Maxis Impact (Bruker Daltoniks, Германия).
Результаты. Проведенный анализ выявил различия профилей метаболитов эмбрионов группы КММВ и группы контроля. Наиболее значимыми являлись регуляторные молекулы (прогестерон, ацетилхолин, олеамид, простагландин A2 и его конъюгат с глутатионом, 2,3-динор-тромбоксан B2 и 20-гидрокси-простагландин E2), аминокислоты и их метаболиты (глутамин, гидроксипролил-глутамат, лизил-гамма-глутамат).
Заключение. Выявлено значительное влияние КММВ на профиль метаболитов в средах культивирования эмбрионов человека 5-х суток развития. Дальнейшие исследования должны быть направлены на анализ влияния выявленных различий на наступление беременности, ее течение и перинатальные исходы.

Для повышения эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) важным является подбор оптимальных параметров культивирования эмбрионов человека [1–4]. При культивировании в условиях in vitro эмбрион постоянно подвергается стрессовым воздействиям, которые он не испытал бы при развитии в организме матери. К ним относятся изменение рН среды культивирования (СК), температурные колебания, воздействие атмосферных концентраций кислорода, естественного и искусственного света [5]. Для оптимизации систем культивирования эмбрионов человека проводится подбор оптимального состава культуральной среды [6–8], однако большинство систем культивирования представляют собой относительно небольшой (до 1 мл) и полностью статичный объем среды [9–11]. Эти условия далеки от тех, в которых находится эмбрион человека в условиях in vivo, – постоянного динамического взаимодействия со своим микроокружением за счет перистальтических сокращений мышечной стенки маточной трубы и биения ворсинок ее слизистой оболочки [12–14].

Помимо секреторного эпителия, слизистая оболочка маточной трубы представлена клетками ворсинчатого эпителия, ворсинки которых постоянно колеблются с частотой от 4,9 (0,2) Гц в пролиферативную фазу до 5,8 (0,3) Гц в секреторную фазу менструального цикла [15, 16]. По данным Исаченко и соавт. [17], в естественных условиях эмбрион находится под постоянным воздействием вибрации с частотой до 20 Гц. Цилиарные сокращения не только оказывают непосредственное воздействие на эмбрион, но и способствуют диффузии питательных веществ [18].

Новым подходом к улучшению условий культивирования эмбрионов человека в программах ВРТ может стать сочетание стандартных систем культивирования с микровибрацией [14, 17, 19, 20], однако влияние контролируемой механической микровибрации на метаболизм и развитие эмбрионов человека на сегодняшний день изучено недостаточно. Цель исследования – оценить влияние контролируемой механической микровибрации на профиль метаболитов в средах культивирования эмбрионов человека на 5-е сутки развития.

Материалы и методы

Характеристика пациентов

В проспективное исследование были включены 44 супружеские пары без наличия противопоказаний и развития осложнений в ходе проведения программ ВРТ. Перед включением в протокол экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) пациентки были обследованы согласно приказу Мин­здрава Российской Федерации от 30.08.2012 №107н «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению» [21]. Критерии включения в исследование: нормальный кариотип обоих супругов, возраст женщины 18–45 лет включительно. Критерии невключения в исследования: использование ооцитов донора, плановая криоконсервация всех полученных ооцитов. Все пациентки подписали добровольное информированное согласие на участие в исследовании. Исследование было одобрено комиссией по этике биомедицинских исследований ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Ку­лакова» Минздрава России.

Отбор и культивирование эмбрионов

Стимуляция функции яичников проводилась по протоколу с антагонистами гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ). В качестве триггера овуляции использовали хорионический гонадотропин или агонист ГнРГ. Эмбрионы культивировали в индивидуальных каплях культуральной среды Irvine CSC (Fujifilm, США) равного объема (25 мкл) в течение 5 дней в смешанной атмосфере N2/O2/CO2 (89/5/6%). Морфологическую оценку эмбрионов по классификации Гарднера (Gardner DK, 1999) проводил эмбриолог через 120–122 ч после оплодотворения. При культивировании в условиях механической микровибрации инкубатор помещали на платформу ArisTT180-s (K&S Advanced Systems Ltd, Израиль) в режиме активной вибрации с частотой 40 Гц в течение 30 секунд с интервалом покоя 30 минут, как было описано ранее [14]. Культивирование в условиях микровибрации осуществляли на протяжении всего срока от получения ооцитов до проведения переноса (или криоконсервации) эмбриона, после чего отбирали СК и криоконсервировали при -80°C. Оценку реальной частоты и амплитуды микровибрации проводили при помощи встроенного осциллографа [14].

Для получения ме...

Романов А.Ю., Эльдаров Ч.М., Фролова А.М., Макарова Н.П., Бобров М.Ю., Долгушина Н.В.