Эпидемиология и Инфекционные болезни. Актуальные вопросы №4 / 2015
Возможность экcпресс-диагностики инфекций мягких тканей, обусловленных стрептококками группы А, чувствительность к антибиотикам и молекулярно-генетические свойства возбудителя
1Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России; 2НИИ антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии Минздрава России
Цель исследования. Оценка возможности использования коммерческих тест-систем, разработанных для экспресс-идентификации стрептококков группы А (СГА) в мазках из глотки, при инфекциях мягких тканей; идентификация emm-типов выделенных стрептококков, изучение их чувствительность к антибиотикам и определение наличия в их геномах генов токсинов.
Материалы и методы. Использовали экспресс-тест-систему «СТРЕПТАТЕСТ» и классический микробиологический метод. Проанализированы истории болезней пациентов с инфекцией мягких тканей гнойно-хирургического отделения Городской клинической больницы № 23 имени «Медсантруд» (Москва) в 2008–2011 гг. Исследовали 118 штаммов СГА, выделенных от пациентов со стрептококковой инфекцией мягких тканей. Молекулярно-генетическими методами определяли emm-тип СГА, а также наличие генов токсинов speA, speB и speC. Чувствительность к антибиотикам исследовали методом микроразведений в катион-сбалансированном бульоне Мюллера–Хинтона (BBL, США) с добавлением лизированной лошадиной крови (итоговая концентрация – 5%).
Результаты. Было определено 34 различных emm-типа СГА, принадлежащих к 9 разным emm-кластерам, из которых самыми многочисленными оказались кластеры D4, E2 и E4. Наиболее распространенными (более 10 штаммов каждый) были emm-типы 66, 88 и 169 (st1731). 21 культура, проявившая устойчивость более чем к одному антибиотику, принадлежала к 11 emm-генотипам. Ген speA был обнаружен у небольшой части инвазивных штаммов. Ложноположительных и ложноотрицательных результатов в исследовании при использовании экспресс-теста не зарегистрировано.
Заключение. Установлено многообразие выделяемых генотипов СГА при инфекциях мягких тканей у пациентов в Москве. Вместе с тем более половины emm-типов относится к 3 кластерам, объединяющим близкородственные М-типы. Выявление полирезистентных штаммов СГА подчеркивает необходимость мониторинга чувствительности выделяемых культур к антибиотикам. Показана перспективность использования тест-системы «СТРЕПТАТЕСТ» для выявления СГА во время хирургических операций у пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей.
Стрептококки группы А (СГА) – этиологические агенты щирокого спектра клинических форм убиквитарно распространенных заболеваний. Полиморфизм клинических проявлений СГА-инфекции в значительной степени определяется типовой структурой и изменчивостью возбудителя, которая может приводить к формированию вариантов СГА с повышенным эпидемическим и патогенным потенциалом. Считается, что уровень заболеваемости респираторными и кожными формами инфекции коррелирует с экономическим развитием страны, и в развитых странах такой показатель минимален [1]. Случаи инвазивных форм СГА-инфекции (ИСИ) регистрируются в разных регионах мира, независимо от социально-экономических условий. В связи с опасностью стремительного нарастания симптомов подобных форм заболевания с возможным развитием синдрома токсического шока и летального исхода решающую роль приобретают экспрессная лабораторная идентификация возбудителя и рациональный выбор лекарственных средств. Для оценки эпидемической ситуации важное значение имеет изучение молекулярно-биологических и генетических свойств циркулирующих стрептококков.
Цель работы – оценка возможности использования коммерческих тест-систем, разработанных для экспресс-идентификации СГА в мазках из глотки, при инфекциях мягких тканей и изучение антибиотикочувствительности и молекулярно-генетических свойств возбудителя, выделенного от больных в хирургическом стационаре.
Материалы и методы
Исследование проводили с мая 2008 г. по март 2011 г. и с ноября 2013 г. по май 2014 г. в гнойно-хирургическом отделении Городской клинической больницы № 23 имени «Медсантруд» (Москва). Всего за исследуемый период (2008–2011) в отделении проходили лечение 4750 пациентов, истории болезней которых были проанализированы. К инвазивным инфекциям были отнесены 132 случая. СГА-этиология была установлена в 46 случаях. Изучение молекулярно-генетических свойств СГА проводили на 35 штаммах, выделенных от больных с ИСИ, и на 66 штаммах от пациентов с другими диагнозами. Большую часть штаммов (91 культура) испытывали на чувствительность к антибиотикам. Апробацию экспрессного метода диагностики СГА осуществляли в 2013–2014 гг.
СГА выделяли из крови или материала, полученного во время операции при первичном нарушении целостности кожного покрова. Посев пробы осуществляли на кровяной агар с добавлением 5% крови барана. После учета результатов первичного посева на агар выделяли чистую культуру и культивировали ее в бульоне Тодда–Хьюита («HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.», Индия) в течение 18 ч при 37 °С. Идентификацию СГА проводили методом латекс-агглютинации с использованием набора реагентов для групповой идентификации Slidex Strepto-Kit («bioMerieux», Франция).
Наличие генов бактериофаговых токсинов speA, speC, а также гена токсина speB, кодируемого хромосомой, определяли методом ПЦР при условиях, описанных ранее [2]. Амплификацию фрагмента гена speB проводили с использованием праймеров: 5’-ACTTATGCTGGTACCGCTGAG-3’; 5’-GAGAGCTACCTGCAGAACCAC-3’. emm-типирование культур СГА проводили в соответствии с протоколом, рекомендованным Centers for Disease Control and Prevention (CDC, США) [http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/protocol_emm-type.htm]. Фрагменты ДНК выделяли из агарозного геля посредством набора Bacterial Genomic DNA Miniprep kit («Axygen», США). Принадлежность штамма к определенному кластеру определяли в соответствии с предложенной системой типирования [3].
Секвенирование ДНК проводили с использованием набора BigDye v.3.1 («Applied Biosystems», США) на генетическом анализаторе ABI 3130x1 согласно инструкции производителя. С целью установления emm-типа и emm-подтипа штаммов полученные последовательности сравнивали с данными, опубликованными в Streptococcus pyogenes emm sequence database [http://www.cdc.gov/ncidod/biotech/strep/strepblast.htm] c помощью программы BLAST2.
Чувствительность к антибиотикам с определением минимальной подавляющей концентрации исследовали методом микроразведений в катион-сбалансированном буль...
