Возможности неинвазивной оценки состояния ооцита и эмбриона при проведении программ ВРТ по профилю экспрессии мРНК факторов роста в фолликулярной жидкости

Одним из ведущих факторов успешного проведения лечения бесплодия при использовании вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) является выбор эмбриона с высоким имплантационным потенциалом. При этом качество эмбриона зависит от состояния ооцита, для которого адекватное взаимодействие с окружающими клетками в процессе фолликулогенеза имеет большое значение. Двунаправленная внутрифолликулярная коммуникация опосредуется через ряд регуляторных молекул – факторов роста, среди которых особую роль играет семейство эпидермальных ростовых факторов, соматомединов и других факторов с формированием целостной системы, изменение баланса в которой может приводить к нарушению развития ооцита.
Цель исследования. Определение взаимосвязи между уровнем экспрессии мРНК факторов роста амфирегулина (AREG); эпирегулина (EREG); гремлина-1 (GREM-1); гепарин-связывающего эпидермального фактора роста (HBEGF); инсулиноподобных факторов роста 1- го и 2-го типов (IGF-1, IGF-2); протеинов, связывающих инсулиноподобные факторы роста 1, 2, 3, 4 типов (IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4); лейкемия-ингибирующего фактора (LIF); рецептора лейкемия-ингибирующего фактора (LIFR); фактора некроза опухолей альфа (TNF-α) в клетках фолликулярной жидкости (ФЖ) и исходами лечения бесплодия при использовании ВРТ.
Материал и методы. Методом количественной полимеразной цепной реакцией с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) проведено исследование профиля мРНК генов AREG, EREG, GREM-1, HBEGF, IGF-1, IGF-2, IGFBP-1, 2,3,4, LIF, LIFR, TNF- α у 67 супружеских пар с различными результатами лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) при переносе одного и двух эмбрионов. Из них с успешным исходом программы ЭКО – 24 пары, с неуспешным – 80 пар (13 пар с самопроизвольным выкидышем до 11 недель, 24 пары с «биохимической» беременностью, с отрицательным – 43 пары.
Результаты. Показано, что в группах с биохимической беременностью и отрицательным результатом ЭКО достоверно повышается уровень экспрессии мРНК факторов роста AREG, EREG, LIFR по сравнению с группой с клинической беременностью. Отмечено значимое повышение экспрессии мРНК IGF-1 в 1,6 раз, (р=0,028) и в 1,2 раза (р=0,04) при биохимической беременности и самопроизвольном выкидыше относительно группы с отрицательным результатом. В группах с неблагоприятным исходом ЭКО и ПЭ отмечена значимая положительная корреляция мРНК соматомедин-связывающих протеинов между собой (IGFBP-2/IGFBP-4) и с LIF.
Заключение. Изучение взаимосвязи уровня экспрессии мРНК факторов роста в фолликулярной жидкости с исходами программ ВРТ представляется перспективным направлением комплексной оценки качества ооцита для селективного переноса одного эмбриона. Увеличение экспрессии мРНК генов AREG, EREG, LIFR ассоциировано с ранними репрдуктивными потерями в программе ЭКО.

Необходимость выявления предикторов компетентности гамет и эмбрионов диктуется базовой клинической стратегией лечения бесплодия – максимум эффективности с минимальным риском. В настоящее время уровень оснащенности лабораторий и центров репродуктологии позволяет применять для объективной оценки гамет и эмбрионов современные достижения в области молекулярной биологии.

Известно, что одним из ведущих факторов успешного проведения лечения бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбриона (ЭКО и ПЭ) является выбор эмбриона с высоким имплантационным потенциалом [1]. При этом качество эмбриона определяется состоянием гамет, в первую очередь, ооцита, для которого адекватное взаимодействие с окружающими клетками в процессе фолликулогенеза имеет большое значение. Двунаправленная коммуникация на межклеточном уровне в Граафовом пузырьке опосредована рядом регуляторных молекул-цитокинов, среди которых важную роль играют факторы роста (ФР), синтезируемые клетками-сателлитами ооцита [2–5].

Ростовые факторы представляют собой семейство секретируемых сигнальных молекул, которые могут индуцировать пролиферацию и дифференцировку клеток [6]. ФР обычно выступают в качестве инициаторов сигнального каскада в клетках путем паракринного, аутокринного (интра, юкстакринного, контактного) и эндокринного воздействия и классифицируются в соответствии со структурой и функцией. Среди ФР выделяют эпидермальные, сосудисто-эндотелиальные, колониестимулирующие, инсулиноподобные, ФР фибробластов, плаценты, нейрональные ФР и др. Все ФР находятся под влиянием эндокринных гормонов, включая половые стероиды и хорионический гонадотропин (ХГ), а также локальных паракринных факторов. Оогенез является стероид-опосредованным процессом, а семейство ФР осуществляет внутрифолликулярную регуляцию созревания ооцита, роста и дифференцировки гранулезных клеток [7–9]. Изменение биоактивности сателлитных клеток влияет на качество ооцита и дальнейшее развитие эмбриона [10–12].

Принимая во внимание, что разработка и внедрение персонифицированных и неинвазивных методов комплексной диагностики состояния ооцита и эмбриона при лечении бесплодия являются актуальными, целью настоящего исследования было определение зависимости профиля экспрессии матричных рибонуклеиновых кислот (мРНК) генов ФР в клетках фолликулярной жидкости (ФЖ) от исходов программы ЭКО при селективном переносе эмбрионов.

Материал и методы исследования

Исследование выполнялось в период с 2010 по 2012 гг. в отделении вспомогательных технологий в лечении бесплодия и лаборатории молекулярно-генетических методов ФГБУ НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова Минздрава России. Проводился анализ профиля экспрессии мРНК генов ФР в клетках ФЖ при селективном переносе одного (elective single embryo transfer, eSET, n=30) или двух эмбрионов (double embryo transfer, DET, n=37) у 67 женщин, которые отвечали основным критериям включения в исследование: трубно-перитонеальный и/или мужской фактор бесплодия; возраст до 35 лет; нормальный или высокий овариальный резерв; не более двух неэффективных попыток ЭКО/интрацитоплазматической инъекции сперматозоида в ооцит (ИКСИ) в анамнезе; отсутствие патологии эндометрия, миомы матки больших размеров, наружного генитального эндометриоза выше II стадии распространения, синдрома поликистозных яичников, тяжелых соматических заболеваний, представляющих угрозу течению беременности и родов; наличие не менее одного эмбриона, пригодного для переноса в полость матки; фертильной или субфертильной спермы супруга, информированного письменного согласия на участие в исследовании. Все супружеские пары были обследованы в соответствии с действующим законодательством, не имели противопоказаний для проведения ЭКО и ПЭ.

В программе ЭКО и ПЭ применялись три варианта стимуляции суперовуляции рекомбинантным ФСГ: протокол с антагонистами гонадотропин-рилизинг гормона (антГнРГ) в 54 циклах; «короткий» протокол с агонистами гонадотропин-рилизинг гормона (аГнРГ) в 20; «длинный» протокол с предварительной десенситизацией гипоталамо-гипофизарно-яичниковой системы с использованием препаратов аГнРГ в 32 циклах.

Гормональное обследование включало определение в сыворотке крови фолликулостимулирующего (ФСГ), лютеинизирующего (ЛГ) гормонов, эстрадиола (Е2), антимюллерового гормона (АМГ) перед началом стимуляции и в день трансвагинальной пункции яичников (ТВП).

На эмбриологическом этапе ЭКО проводилась оценка качества ооцитов в соответствии с адаптированной по L.L. Veeck (2005) классификацией клиники Bourn Hall [13]. Переносу подлежали только эмбрионы «хорошего» качества [13, 14], то есть имеющие на 3-и сутки 6–8 или более бластомеров с правильной формой, отсутствием безъядерных фрагментов и/или наличием фрагментов цитоплазмы, занимающих не более 10% объема; на 5-е сутки – достигшие стадии бластоцисты, имеющие примерно 150–200 клеток, компактную внутренн...

Смольникова В.Ю., Калинина Е.А., Краснощока О.Е., Донников А.Е., Бурменская О.Е., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т.