Взаимосвязь патозооспермии и анеуплоидии хромосом в сперматозоидах и эмбрионах в программах вспомогательных репродуктивных технологий

01.04.2013
978

ФГБУ Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова Минздрава России; ООО Центр материнства и репродуктивной медицины «Петровские Ворота»

В обзоре приведена сравнительная оценка распространенности анеуплоидии в ядрах сперматозоидов и эмбрионов у супружеских пар с нарушением и сохранением репродуктивной функции у мужчин. Приведены данные исследований, в которых изучалась связь различных видов патозооспермии и анеуплоидии хромосом в ядрах сперматозоидов. Оценено влияние анеуплоидии хромосом в ядрах сперматозоидов на уровень анеуплоидии хромосом эмбрионов. Проведен анализ исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий у супружеских пар c повышенным уровнем анеуплоидии хромосом в ядрах сперматозоидов у мужчин. Рассмотрены возможности применения преимплантационной генетической диагностики как меры профилактики рождения детей с генетической патологией у данной категории пациентов.

На протяжении многих лет ошибочно считалось, что бесплодие в большей степени связано с проблемами в репродуктивной системе женщин. Однако исследования последних лет показали, что мужской фактор занимает не менее 40–50% в структуре причин бесплодия [1, 2]. Многие исследователи отмечают ухудшение параметров мужской спермограммы за последние десятилетия. Carlsen и соавт. (1992) были оценены качественные и количественные показатели спермограммы у 14 947 здоровых мужчин из разных стран мира в возрасте от 17 до 64 лет за период с 1938 по 1990 г. [3]. С помощью линейного регрессионного анализа было установлено, что концентрация сперматозоидов за указанный период времени снизилась с 113 млн/мл до 66 млн/мл (в 1,7 раза), а объем эякулята
– с 3,4 до 2,75 мл. Схожие данные были получены в исследовании Swan и соавт. [4].

В настоящее время большое внимание уделяется изучению молекулярных и генетических факторов, лежащих в основе причин бесплодия. Известно, что у мужчин с патозооспермией частота хромосомной патологии выше, чем у здоровых мужчин. Хромосомные нарушения у этой категории пациентов составляют 5–15%. При этом аномалии гоносом встречаются примерно в 70%, а аномалии аутосом – в
30% наблюдений [5, 6]. Пациенты с изменениями в кариотипе имеют высокий риск рождения детей с
хромосомной патологией из-за неправильного расхождения хромосом в мейозе, и, как следствие, появления у потомства несбалансированных транслокаций и анеуплоидии в кариотипе.

Анеуплоидия – это некратное гаплоидному набору изменение числа хромосом в клетках организма за
счет потери или добавления отдельных хромосом. По типу вовлеченных хромосом выделяют анеуплоидию половых хромосом и аутосом. По числу вовлеченных хромосом анеуплоидию классифицируют как нуллисомию при отсутствии пары гомологичных хромосом, моносомию при отсутствии одной из пары гомологичных хромосом, трисомию при наличии добавочной хромосомы. Для половых хромосом у человека также описаны случаи тетрасомии и пентасомии и их мозаичные варианты. Нарушения расхождения хромосом могут возникать как при первом, так и при втором делении мейоза. Существенный интерес представляют пациенты с нормальным кариотипом, у которых отмечаются анеуплоидии хромосом в отдельных клетках и тканях.

Для определения анеуплоидии хромосом широко используется молекулярно-цитогенетический
метод – флюоресцентная in situ гибридизация (FISH-метод). Одними из первых анализ хромосом в сперматозоидах человека с помощью FISH-метода провели Joseph и соавт. (1984) [7]. Данная техника значительно облегчила исследование частоты нерасхождения хромосом в сперматозоидах. На сегодняшний день этот метод зарекомендовал себя как точный и доступный для определения хромосомной анеуплоидии. По данным некоторых исследователей уровень анеуплоидии хромосом в сперматозоидах у фертильных мужчин варьирует от 0,21% до 1% [8, 9]. Однако точного референсного значения числа анеуплоидных сперматозоидов в мужском эякуляте не существует.

Проспективные исследования демонстрируют, что уровень анеуплоидии хромосом в ядрах сперматозоидов у мужчин с патозооспермией выше по сравнению с мужчинами с нормозооспермией [9–11]. Особенно часто повышение уровня анеуплоидии хромосом в половых клетках отмечается у мужчин с тератозооспермией. В исследовании Mehdi и соавт. (2012) общий
уровень анеуплоидии хромосом в ядрах сперматозоидов у мужчин с тератозооспермией был значительно выше, чем у фертильных мужчин, и составил 5,52 и 1% соответственно. Наибольший риск возникновения анеуплоидии хромосом в половых клетках наблюдался у мужчин с макроцефалией сперматозоидов [9]. Сходные результаты были получены при исследовании Rives и соавт. (2000) и Brahem и соавт. (2011) [12, 13]. В ряде исследований было выявлено, что олигозооспермия также коррелировала с повышенным уровнем анеуплоидии гоносом в сперматозоидах и встречалась в 2,5 раза чаще, чем при нормозооспермии [14]. Сниженная подвижность сперматозоидов характеризовалась значительным увеличение уровня анеуплоидии по сравнению с контрольной группой, по данным Collodel и соавт. [15]. В исследовании, проведенном в Ливане, также была выявлена более высокая частота дисомии по половым хромосомам у мужчин с астенозооспермией по сравнению с фертильными мужчинами [16]. Как следствие повышенного риска развития анеуплоидии сперматозоидов, было высказано предположение о том, что полученные эмбрионы также имеют более высокий риск развития анеуплоидии хромосом.

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД) у человека стала возможной в начале 90-х
годов, когда был достигнут достаточный технологический уровень проведения экстракорпорального
оплодотворения (ЭКО), а также разработан метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющей
проводить анализ ДНК в единичных клетках. Впервые ПГД применили Handyside и соавт. в 1989 г. [17].
Они определяли специфические последовательности Y-хромосомы методом ПЦР с целью определения
пола эмбрионов. В настоящее время технику ПЦР применяют для выявления мутаций в уникальных
генах, то есть генах, представленных единственной копией в гаплоидном наборе хромосом. В дальнейшем для определения пола эмбриона и диагностики хромосомной патологии стали применять метод FISH, который имеет ряд преимуществ перед другими способами молекулярной гибридизации. Для генетического исследования этим методом не требуется получение большого количества биологического материала и выделение ДНК из клеток, что позволяет анализировать хромосомы на всех стадиях клеточного цикла, в том числе в интерфазе мейоза, что в ряде случаев позволяет обходиться без исследования метафазных пластинок. Ограничением FISH метода является то, что только ограниченное число хромосом может быть проанализировано в каждом эмбрионе. На сегодняшний день стало возможным проведение полного кариотипирования отдельных клеток при помощи метода сравнительной геномной гибридизации (CGH). Метод CGH был первоначально разработан для анализа анеуплоидии в клетках, полученных из солидных опухолей [18]. Сейчас метод
CGH применяется для ПГД человеческих эмбрионов. Однако и он имеет ряд ограничений. При помощи
CGH нельзя обнаружить нарушение плоидности хромосом (триплоидию, полиплоидию и др.) и сбалансированные транслокации или инверсии. Также ограничением метода является его высокая стоимость. Процедура CGH является достаточно трудоемкой.

Иногда до получения результата проходит несколько дней. Поэтому после биопсии 3-дневные эмбрионы иногда подвергаются криоконсервированию. Далее эти эмбрионы могут быть перенесены женщине только в следующем цикле. Как было показано в ряде исследований, криоконсервация эмбрионов после биопсии приводит к значительному снижению их жизнеспособности [19, 20]. Однако каким бы способом ни проводилась ПГД, ее применение увеличивает частоту имплантации эмбрионов и снижает риск возникновения спонтанных абортов, тем самым повышая эффективность программ ВРТ [21–23].

Исследования по типу случай-контроль продемонстрировали зависимость хромосомной патологии у
потомства с анеуплоидией сперматозоидов у отцов. При исследовании сперматозоидов у отцов детей с
синдромом Дауна было выявлено, что частота сперматозоидов с дисомией хромосомы 21 была выше
по сравнению с контрольной группой [24]. У пар со спонтанными абортами в анамнезе или рождением
детей с хромосомными нарушениями в гоносомах (синдром Тернера, синдром Клайнфельтера) также
было отмечено увеличение частоты анеуплоидии в половых хромосомах сперматозоидов (от 0,2 до 24,7%) [25–27]. Magli и соавт. (2009) изучали риск развития анеуплоидии хромосом в эмбрионах, полученных от супружеских пар с различными видами патозооспермии у мужчин олигоастенотератозооспермия (ОАТ) или необструктивная азооспермия (НОА)) [28]. Было выявлено, что частота анеуплоидных эмбрионов составила 62% у мужчин с ОАТ, 69% – у мужчин с НОА, и 55% – у мужчин с нормозооспермией. В исследовании Dubey и соавт. были получены сходные данные [29]. Как следствие выявленных нарушений, авторы отмечают более высокую частоту имплантации, частоту наступления беременностей и живорождений в программах ВРТ у пациентов с нормальными показателями спермограммы по сравнению с мужчинами с патозооспермией. Бельгийскими коллегами
было изучено влияние тератозооспермии на исходы внутриматочной инсеминации. Частота живорождений была выше в группе супружеских пар с нормальными показателями спермограммы у мужчин по сравнению с парами, в которых у мужей отмечалась тератозооспермия (52,8 и 33,4% соответственно) [30].

Таким образом, патозооспермия у мужчин может являться причиной неудачных исходов программ
ВРТ. При наличии патозооспермии может наблюдаться повышенная частота анеуплоидии эмбрионов
вследствие более высокого уровня анеуплоидии сперматозоидов. Ученые из Южной Кореи исследовали
влияние патозооспермии на риск развития анеуплоидии эмбрионов [31]. Частота анеуплоидии хромосом 13, 18, 21, X и Y была выше в группе мужчин с ОАТ по сравнению с контрольной группой. Количество сперматозоидов обратно коррелировало с частотой диплоидии хромосом 13 и 21 в группе пациентов с OAT. Sánchez-Castro и соавт. исследовали супружеские пары, в которых у мужей отмечался высокий уровень анеуплоидии хромосом в сперматозоидах. Анализ данных показал, что у таких супружеских пар частота встречаемости анеуплоидии в эмбрионах была намного выше [32]. Наиболее крупное исследование было проведено бельгийскими авторами Magli и соавт. (2009) [28]. В этом исследовании оценивался отцовский вклад в развитие анеуплоидии эмбрионов. Были проанализированы хромосомы X, Y, 13, 15, 16, 17, 18, 21 и 22 . В результате исследования было
выявлено, что 40% эмбрионов были нормальными по изучаемым хромосомам. Частота хромосомных
нарушений была значительно ниже в группе пациентов с нормозооспермией (55%) по сравнению с
пациентами с ОАТ (62%) и НOA (69%), р<0,005. В случаях обструктивной азооспермии доля эмбрионов с хромосомными аномалиями составила 63%. Наблюдалось значительное увеличение уровня анеуплоидии в зависимости от тяжести патозооспермии. Количество эмбрионов хорошего качества было значительно выше в группе пациентов с нормальными показателями спермограммы, и составила 40 против 16% в группе с патологией сперматогенеза. В исследовании американских коллег частота эмбрионов с анеуплоидией также была выше в группе мужчин с патозооспермией, чем в группе мужчин с нормальными показателями спермограммы [29]. Частота наступления беременности на цикл составила 44% при нормозооспермии и 14% при тератозооспермии. Частота имплантаций в группе здоровых мужчин была в два раза выше по сравнению с группой мужчин с патозооспермией. Нами был проведен систематический обзор, в котором были обобщены данные о частоте и типах анеуплоидии эмбрионов, полученных от пар в программах ЭКО, в которых у мужчин отмечалась патозооспермия [33]. При обобщении полученных данных была выявлена статистически значимая зависимость между патозооспермией и риском развития анеуплоидии эмбрионов в программах ВРТ.

Таким образом, можно сделать заключение, что проведение программ ВРТ у пациентов с патозооспермией требует определенной генетической настороженности. Эффективная диагностика c помощью молекулярной гибридизации в условиях in situ способствует успешному и своевременному обнаружению хромосомных аберраций как в мужских половых клетках, так и в ядрах бластомеров. Исследование сперматозоидов на наличие анеуплоидии и проведение последующей ПГД может служить хорошим профилактическим мероприятием, повысить эффективность программ ВРТ и способствовать рождению здорового потомства у этой категории пациентов.

Список литературы

1. World Health Organization. WHO Manual for the Standardized Investigation and Diagnosis of the Infertile Couple. Cambridge: Cambridge University Press, 2000.
2. Dohle G.R., Colpi G.M., Hargreave T.B., Papp G.K., Jungwirth A., Weidner W. EAU Group on Male Infertility. EurUrol2005; 48(5):703–11.
3. Carlsen E., Giwermann A., Keiding M., Skakkeback NE. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years. BMJ 1992; 305(6854):609–13.
4. Swan S.H., Elkin E.P., Fenster L. The question of declining sperm density revisited: an analysis of 101 studies published 1934-1996. Environ Health Perspect 2000;108(10):961–6.
5. Hofherr S.E., Wiktor A.E., Kipp B.R., Dawson B.P., Van Dyke D.L.. Clinical diagnostic testing for the cytogenetic and molecular causes of male infertility: the Mayo Clinic experience. J Assist Reprod Genet 2011; 28(11):1091–8.
6. Bertini V., Simi P., Valetto A. Cytogenetic study of 435 subfertile men: incidence and clinical features. J Reprod Med. 2006; 51(1):15–20.
7. Joseph A.M., Gosden J.R., Chandley A.C. Estimation of aneuploidy levels in human spermatozoa using chromosome specific probes and in situ hybridization. Hum Genet 1984. 66(2-3):234–8.
8. Глинкина Ж.И. Медико-генетические аспекты обследования супружеских пар с бесплодием, включенных в программу ЭКО и ПЭ, ИКСИ. Дисс.канд.мед.наук . Москва 2003; 72–74.
9. Mehdi M., Gmidene A., Brahem S., Guerin J., Elghezal H., Saad A. Aneuploidy rate in spermatozoa of selected men with severe teratozoospermia. Andrologia 2012; 44(Suppl 1):139–43.
10. Shi Q., Martin R.H. Aneuploidy in human spermatozoa: FISH analysis in men with constitutional chromosomal abnormalities, and in infertile men. Reproduction 2001; 121(5):655–66.
11. Tempest H.G., Griffin D.K. The relationship between male infertility and increased levels of sperm disomy. Cytogenet Genome Res 2004;107(1-2):83–94.
12. Rives N., Joly G., Machy A., Simeon N., Leclerc P., Macé B. Assessment of sex chromosome aneuploidy in sperm nuclei from 47, XXY and 46, XY/47, XXY males: comparison with normal karyotype. Mol Hum Reprod 2000;6:107–12.
13. Brahem S., Mehdi M., Elghezal H., Saad A. Detection of DNA fragmentation and meiotic segregation in human with isolated teratozoospermia. J Assist Reprod Genet 2011; 28:41–48.
14. Mehdi M., Smatti B., Saad A., Guerin J.F., Benchaib M. Analysis by fluorescence in situ hybridization (FISH) of the relationship between gonosomic aneuploidy and the results of assisted reproduction in men with severe oligozoospermia. Andrologia 2006; 38(4):137–41.
15. Collodel G., Capitani S., Baccetti A., Pammolli E., Moretti E. Sperm aneuploidies and low progressive motility. Hum Reprod 2007; 22(7):1893–8.
16. Younes B.G., Hazzouri K.M., Chaaban M.J., Karam W.G. et al. High Frequency of Sex Chromosomal Disomy in Spermatozoa of Lebanese Infertile Men. J Androl 2011; 32(5): 518–23.
17. Handyside A.H., Pattinson J.K., Penketh R.J., Delhanty J.D., Winston R.M., Tuddenham E.G. Biopsy of human preimplantation embryos and sexing by DNA amplification. Lancet 1989; 1(8634):347–9.
18. Kallioniemi O.P., Kallioniemi A., Sudar D., Rutovitz D. et al. Comparative genomic hybridization: a rapid new method for detecting and mapping DNA amplification in tumors. Semin Cancer Biol 1993;4(1):41–6.
19. Ciotti P.M., Lagalla C., Ricco A.S., Fabbri R., Forabosco A., Porcu E. Micromanipulation of cryopreserved embryos and cryopreservation of micromanipulated embryos in PGD. Mol Cell Endocrinol 2000; 169(1-2):63–7.
20. Magli M.C., Gianaroli L., Fortini D., Ferraretti A.P., Munné S. Impact of blastomere biopsy and cryopreservation techniques on human embryo viability. Hum Reprod 1999;14(3):770–3.
21. Gianaroli L., Magli M.C., Ferraretti A.P., Tabanelli C., Trombetta C., Boudjema E. The role of preimplantation diagnosis for aneuploidies. Reprod Biomed Online 200; 4(Suppl 3):31–36.
22. Munné S. Preimplantation genetic diagnosis of numerical and structural chromosomal abnormalities. Reprod.Biomed Online 2002; 4(3):183–96.
23. Munné S., Bahçe M., Sandalinas M., Escudero T. et al. Differences in chromosome susceptibility to aneuploidy and survival to first trimester. Reprod Biomed Online 2004; 8(1):81–90.
24. Blanco J., Gabau E., Gomez D., Baena N. et al. Chromosome 21 disomy in the spermatozoa of the fathers of children with trisomy 21, in a population with high prevalence of Down syndrome increased incidence in cases of paternal origin. Am J Hum Genet 1998; 63(4):1067–72.
25. Martınez-Pasarell O., Nogu_es C., Bosch M., Egozcue J., Templado C. Analysis of sex chromosome aneuploidy in sperm from fathers of Turner syndrome patients. Hum Genet 1999; 104(4):345–9.
26. Eskenazi B., Wyrobek A.J., Kidd S.A., Lowe X. et al. Sperm aneuploidy in fathers of children with paternally and maternally in herited Klinefelter syndrome. Hum Reprod2002;17(3):576–83.
27. Tang S.S., Gao H., Robinson W.P., Ho Yuen B., Ma S. An association between sex chromosomal aneuploidy in sperm and abortus with 45, X of paternal origin: possible transmission of chromosomal abnormalities through ICSI. Hum Reprod 2004;19(1):147–51.
28. Magli M.C., Gianaroli L., Ferraretti A.P., Gordts S., Fredericks V., Crippa A. Paternal contribution to aneuploidy in preimplantation embryos. Reprod Biomed Online 2009; 18(4):536–42.
29. Dubey А., Dayal M.B., Frankfurter D., Balazy P., Peak D., Gindoff P.R. The influence of sperm morphology on preimplantation genetic diagnosis cycles outcome. Fertil Steril 2008; 89(6):1665–9.
30. Spiessens C., Vanderschueren D., Meuleman C., D'Hooghe T. Isolated teratozoospermia and intrauterine insemination. Fertil Steril 2003; 80(5):1185–9.
31. Pang M.G., Kim Y.J., Lee S.H., Kim C.K. The high incidence of meiotic errors increases with decreased sperm count in severe male factor infertilities. Hum Reprod 2005; 20(6):1688–94.
32. Saґnchez-Castro M., Jimeґnez-Macedo A.R., Sandalinas M., Blanco J., Prognostic value of sperm fluorescence in situ hybridization analysis over PGD Human Reproduction, 2009 Vol.24, No.6 : 1516–152.
33. Долгушина Н.В., Ратушняк С.С., Сокур С.А., Глинкина Ж.И., Калинина Е.А. Риск анеуплоидии эмбрионов в программах вспомогательных репродуктивных технологий у мужчин с патозооспермией (мета-анализ). Акушерство и гинекология 2012; 7:4–13.

Об авторах / Для корреспонденции

Сокур Светлана Александровна, аспирант лаборатории репродуктивной генетики ФГБУ Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова Минздрава России.
117485, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
E-mail: sokursv@yandex.ru

Долгушина Наталия Витальевна, доктор медицинских наук, руководитель Службы научно-организационного обеспечения ФГБУ Научный Центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова Минздрава России.
117485, Москва, ул. Академика Опарина, д. 4.
Телефон: 8 (495) 438-49-77.
E-mail: n_dolgushina@oparina4.ru

Глинкина Жанна Ивановна, доктор биологических наук, заведующая лаборатории репродуктивной генетики ООО Центр материнства и репродуктивной медицины «Петровские Ворота».
127051, Россия, Москва, 1-й Колобовский переулок, д. 4.
E-mail: z_glinkina@oparina4.ru

Нет комментариев

Комментариев: 0

Вы не можете оставлять комментарии
Пожалуйста, авторизуйтесь